牛细小病毒感染(Bovine parvovirus infection)是由牛细小病毒(Bovine parvovirus, BPV)引起牛的一种主要以母牛生殖机能障碍和犊牛消化道、呼吸道症状为特征的传染性疾病。1961年Abinanti和Warfield首次从健康犊牛粪便中分离出细小病毒。因其具有血细胞吸附性能,故又称血细胞吸附肠病毒(Hemadsorbing enteric, HADEN)。其后从暴发BPV感染的牛群中进行病毒的分离鉴定和血清学调查,结果表明在一些牛群中BPV感染发病率较高,亦有血清学调查报道目前该病属全球范围流行。目前,我国对牛细小病毒及其感染研究较少,我国牛群是否存在细小病毒感染,其感染和危害的程度如何,尚缺乏较为清晰的背景资料。实践中缺乏检测BPV感染的抗原与抗体试剂也制约了我国对该病的检测。因此研究开发出检测BPV感染特异性强、敏感性高的病原和血清检测试剂显得尤为重要。首先,本研究根据GenBanK上公布的BPV基因组序列,选取VP2基因高度保守区域作为靶基因,通过生物学软件设计筛选出1套LAMP引物。以BPV原代细胞培养物提取DNA为模板,建立BPV-LAMP检测方法,并对反应温度、时间、镁离子浓度等条件进行优化。结果表明,LAMP最佳反应温度是63℃,反应时间为60min,镁离子浓度为8mM/L,甜菜碱浓度为1.2mM/L, FIP和BIP的浓度分别为1.6μM/L, F3和B3的浓度分别为0.2μM/L,内外游引物浓度比为8：1。经过优化后初步建立的BPV-LAMP方法,最低可检测到9个拷贝的BPVDNA,是普通PCR方法敏感性的100倍。与可能存在交叉反应的病毒进行特异性试验,只有BPV扩增出特异性条带,而其他病毒(BRY、BVDV、BHV、GPV、PPV)均为阴性,无交叉反应。表明建立的BPV-LAMP方法具有良好的敏感性和特异性。此方法可根据反应后的扩增产物是否变浑浊判定结果,或加入SYBR Green I染料,在自然光或紫外光下判定结果。采用LAMP和PCR同时检测59份粪便样本,两种方法检测结果的符合率为94.9%。结果表明,建立的BPV-LAMP具有快速、敏感、特异、重复性好等优点,可用于临床BPV感染的检测。本研究根据GenBanK上公布的BPVVP2基因设计引物,以BPV-VR767株的DNA为模板,采用PCR扩增出2019bp的VP2基因,利用生物学软件对VP2基因序列进行抗原性预测分析,选择抗原性优势区域,将VP2基因分为三段(34-263aa,300-451aa和484-633aa),分别克隆到原核表达载体pET-28a上,获得了重组质粒pET-28a-VP2-1、pET-28a-VP2-2和pET-28a-VP2-3,将其分别转化E.coli BL21或Rosetta,经IPTG诱导后,分别得到大小为30.2ku、22.7ku和22.9ku的目的蛋白。经Western-blot和间接ELISA分别检测三个重组蛋白的反应原性；用纯化的三个重组蛋白分别免疫昆明鼠,利用间接ELISA检测抗体产生的效价和特异性识别重组抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示,Western-blot和间接ELISA证实BPV阳性血清均能够识别三个重组蛋白,表明表达的三个重组蛋白均具有抗原性；免疫小鼠中均产生特异性抗体,血清效价最高可达1.28×105,制备的三种重组蛋白抗血清均可与BPV全病毒抗原发生特异性反应,说明制备的抗血清均可识别BPV抗原,三个重组蛋白均具有良好的免疫原性。其中VP2-3(484-633aa)基因片段所表达的重组蛋白抗原性最好,表明分段表达并纯化的VP2蛋白具有病毒天然蛋白抗原反应活性。利用纯化后的重组VP2-3蛋白作为包被抗原,建立了检测BPV抗体的间接ELISA方法。通过试验确定了最佳反应条件,抗原的最适包被浓度为20μg/mL、血清最佳稀释倍数为1:40、血清最适作用时间为lh、最适封闭液为2.5%脱脂乳、酶标抗体最佳稀释倍数为1:5000、酶标抗体最适作用时间为Ih. OPD-H202最佳显色时间为10min。判定标准为OD490nm≥0.185者判为抗体阳性,否则判为抗体阴性。包被的重组抗原不与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒(BHV)、牛副流感病毒3型(BPI3)和牛布鲁氏菌病(B.abortus)的阳性血清发生交叉反应,表明建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性。该方法与血凝抑制试验相比较,符合率为91.38%。用该方法对黑龙江省部分地区采集到的678份牛血清样品进行检测,结果有353份血清为阳性,总阳性率为52.1%。上述结果显示,建立的检测牛细小病毒抗体的间接ELISA方法可为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。