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土壤是人类赖以生存和发展的基础!当前,我国土壤有机污染状况严峻。多环芳烃(PAHs)是土壤中一类常见的有机污染物,其疏水性强、难降解、易在土壤中积累。土壤中PAHs可被植物吸收,并通过食物链的传递严重危害动物与人群健康。随着社会对农产品安全问题的日益关注,如何规避污染区农产品PAHs污染已成为环境领域研究的热点之一。植物根表存在的细菌生物膜具有促进作物增产、提高植物抗逆性等功能;然而,能否利用植物根表细菌生物膜来调控植物吸收PAHs,进而防治土壤PAHs污染、降低农作物PAHs污染风险?国内外对此至今仍少有了解。本论文从采自PAHs污染场地的健康植物根表分离筛选了 2株可高效降解菲的功能菌株RS1和RS2,研究了环境条件对菌株降解菲的影响,分析了菌株降解PAHs的广谱性及对抗生素的抗性;探讨了野生功能菌株的成膜能力及绿色荧光蛋白(gfp)基因标记菌株的降解性能和成膜能力;通过温室盆栽试验,进一步研究了gfp标记的功能菌株RS2(即45-RS2)根表定殖成膜对紫花苜蓿生长的影响,初步探讨了菌株45-RS2在根表的定殖成膜作用对紫花苜蓿吸收菲的影响及机理。主要研究成果如下:(1)从采自PAHs污染场地的健康植株(小飞蓬、车前草、蛤蟆草)根表分离筛选得到2株可高效降解菲的功能细菌RS1和RS2。经生理生化实验和16S rRNA基因序列同源性分析,确定菌株RS1和RS2均为Sphingobiumsp.细菌。功能菌株RS1和RS2能以菲为唯一碳源和能源生长,能够在实验室培养条件下高效降解菲。以5%接菌量(OD600nm=0.3)接种功能菌株RS1和RS2至PMM(100 mg· L-1)培养基,在30℃、150 r·min-1恒温摇床培养72 h,对菲的降解率分别达到88.9%和98.3%,菌株的菌体数量最大值分别达到9.53和10.05 log cfu·mL-1。环境条件对菌株降解菲效率的影响表明:菌株RS1降解菲的最适温度为30℃,适宜pH值范围为5.0～7.0;菌株RS2的最适温度为37℃,适宜pH值范围为5.0～7.0。在供试条件下,底物菲浓度(50～250 mg·L-1)越高,菌株RS1和RS2对菲的降解率越低;接种量(1～15%)越大,菌株RS1和RS2对菲的降解率越高。功能菌株RS1和RS2能以苊、蒽、芘和苯并[a]芘等其他单一 PAH为唯一碳源和能源生长。相同培养时间,菌株RS1对单一 PAH蒽、芘和苯并[a]芘的降解率均低于RS2,对苊的降解率比RS2高。菌株RS1和RS2对8种抗生素的抗性差异不大,均可在含有氨苄青霉素(200 mg·L-1)、卡那霉素(25 mg·L-1)、链霉素(200 mg’L-1)和低浓度氯霉素(10mg·L1)的培养基中生长;此外,菌株RS1和RS2对红霉素的抗性有微小差异,菌株RS2(100mg·L-1)对红霉素的抗性比RS1(75mg·L-1)强。(2)明确了功能菌株RS1和RS2的成膜能力,并对菌株RS2进行了gfp基因标记。以pBBRGFP-45为供体质粒,pRK2013为辅助质粒,菌株RS1和菌株RS2分别为受体质粒,通过三亲接合方式,成功将gfp基因导入目标菌株体内,并命名为45-RS1和45-RS2。通过在30℃恒温培养箱中静置培养,菌株RS1和RS2均能在微型离心管中形成生物膜。菲降解能力和细菌成膜能力的验证结果表明,gfp基因没有明显干扰菌株45-RS2对菲的降解能力和成膜能力。分别以5%接菌量(OD600 nm=1.0)接种功能菌株 RS2 和 45-RS2 至 PMM(100mg·L-1)培养基,在 30℃、150r·min-1 恒温摇床培养72 h,对菲的降解率均达到99.2%,菌株的菌体数量分别达到最大值8.67和9.62 log cfu·mL-1。通过温室盆栽试验,证实菌株45-RS2能有效地定殖到紫花苜蓿根表形成细菌生物膜。(3)功能菌株45-RS2在紫花苜蓿根表的定殖和成膜作用可显著降低植物体内的菲浓度以及菲在植物体内的积累(P<0.05)。通过灌根或浸种处理,菌株45-RS2均能良好地定殖在紫花苜蓿的根表,并形成细菌生物膜;同时,部分菌株可进入植物根部,并随蒸腾流迁移到茎叶部。功能菌株45-RS2在植物根表的定殖能促进紫花苜蓿的生长,且有效降低了紫花苜蓿根部的菲含量,说明功能菌株45-RS2在植物根表的定殖和成膜作用能促进紫花苜蓿根部菲的代谢同时降低了菲在宿主植物体内的积累。(4)功能菌株45-RS2在紫花苜蓿根表的定殖可以影响植物体内PAHs代谢相关酶系活性。在不接菌对照组中,菲胁迫使紫花苜蓿根部过氧化物酶(POD)活性增强,多酚氧化酶(PPO)活性下降,而过氧化氢酶(CAT)活性变化无显著性差异,茎叶部POD和PPO活性均得到显著提高(P<0.05),CAT活性变化不显著。在无菲污染处理中,接种功能菌株使紫花苜蓿根部和茎叶部POD和PPO活性增强,CAT活性减弱。在菲和功能菌株共同作用下,紫花苜蓿根部POD和CAT活性减弱,茎叶部PPO活性增强,而CAT活性变化不显著。在菲胁迫下,浸种方式接种功能菌株使紫花苜蓿体内的POD活性增强,而灌根方式对紫花苜蓿体内POD活性影响不显著。