目的:目前,手术,化疗和放疗是肿瘤治疗的3大手段,这些手段均不能消灭最后一个残留的癌细胞,而生物治疗最有希望达到这一目标。近年来,开展DC细胞作为肿瘤生物治疗和基因治疗的方案已经获得FDA标准进入Ⅲ期临床,该疗法比传统的LAK细胞治疗和CIK细胞疗法更有特异性,以及更强大的杀瘤活性。但子宫内膜癌树突状疫苗的研究国内外鲜有报道。由于目前子宫内膜癌的肿瘤特异性抗原不明确,应用全细胞性肿瘤抗原冲击致敏DC的方法来制备树突状疫苗不失为一种简便而有效的方法。本研究目的在于观察人子宫内膜癌细胞株Ishikawa冻融抗原致敏的人脐带血单核细胞来源的DC活化的CTL对裸鼠移植瘤的预防和治疗作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法:1分离正常足月产妇分娩后新生儿脐血单个核细胞(mononu- clear cells ,MNCs),加入含细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4的培养剂常规培养,每3天半量换液1次,补全量细胞因子。第3天向DC诱导体系中按照1:10的细胞比例加入Ishikawa冻融抗原,第五天加入TNF-α。第7天收集细胞;与分离的T淋巴细胞按照1:10的比例混合培养3天。倒置显微镜下观察树突状细胞以及T淋巴细胞形态。2将30只裸鼠随机选择15只,收集处于对数生长期(logarith- mic growth phase)的细胞系Ishikawa,建立裸鼠子宫内膜癌皮下移植瘤模型。选择肿瘤体积长至100mm3的10只裸鼠,在瘤旁皮下分别注射DC活化的CTL、冻融抗原活化的CTL及完全培养基,每7天接种1次,连种3次。每4天测量一次移植瘤大小,并以公式V=1/6πabc计算肿瘤体积(abc为肿瘤互相垂直的直径),绘制移植瘤生长曲线。3从余下的15只裸鼠中随机分为3组,每组5只,分别于左侧背部皮下接种DC活化的CTL、冻融抗原活化的CTL及完全培养基。3天后将对数生长期的细胞系Ishikawa接种于这两组裸鼠的右侧背部皮下;每4天观察一次裸鼠移植瘤的形成情况,并以公式V =1/6πabc计算移植瘤体积(V为体积,abc为肿瘤互相垂直的直径),直到接种后第20天。4镜下观察各治疗组Ishikawa移植瘤标本的形态:透射电子显微镜下观察Ishikawa移植瘤标本肿瘤细胞超微结构。5应用流式细胞仪检测DC活化的CTL组和冻融抗原活化的CTL组以及治疗组对照组Ishikawa移植瘤的凋亡率。6应用流式细胞仪检测DC活化的CTL组和冻融抗原活化的CTL组以及治疗组对照组Ishikawa移植瘤细胞中Fas膜蛋白的表达。7应用免疫组化SP法检测DC活化的CTL组和冻融抗原活化的CTL组以及治疗组空白对照组Ishikawa移植瘤组织中Survivin的表达。结果1脐血来源的单个核细胞体外应用rhGM-CSF, rhIL-4, TNF-α和冻融抗原培养7天后,生成了具有典型形态的成熟DC。冻融抗原负载DC活化的T淋巴细胞比单纯冻融抗原活化的T淋巴细胞形成的集落大,且增殖快。2 Ishikawa裸鼠皮下移植瘤生长曲线:冻融抗原负载DC激活的CTL治疗组较单纯冻融抗原负载的CTL治疗组抑制肿瘤生长作用明显。3不同CTL治疗组间移植瘤体积比较:冻融抗原负载DC活化CTL治疗组,移植瘤组织治疗后的体积较前明显缩小(P<0.01);单纯冻融抗原活化的CTL治疗组移植瘤组织治疗后的体积较前略缩小(P<0.05);而冻融抗原负载DC活化CTL治疗组治疗后的体积明显小于单纯冻融抗原活化的CTL治疗组,二者比较有统计学差异(P<0.05)。两治疗组第20天的肿瘤体积均与对照组(完全培养基组)有显著差异(P<0.01)。4在预防组的实验中,皮下接种瘤细胞21天后,冻融抗原负载DC活化的CTL治疗组仅一只于第8天出现瘤结节,移植瘤发生率16. 6 %;单纯冻融抗原活化的CTL治疗组中,于接种肿瘤细胞系Ishikawa后4天即见移植瘤出现,移植瘤发生率63 %。而对照组移植瘤发生率100 %。前组与后两组有显著性差异(P<0.05)。5在冻融抗原负载DC活化的CTL组中,扫描电镜下观察到肿瘤组织凋亡的早期信号,表现为:凋亡细胞的部分核膜向外呈锐角突起和凋亡征象表现为细胞核染色质浓缩并凝结成块,聚集在核膜周围呈半月或新月状,细胞浆浓缩,内质网变疏松并与胞膜融合形成空泡。在其他两治疗组中,则未见到明显凋亡征象。6流式细胞术凋亡率的测定:冻融抗原负载DC活化的CTL治疗组与对照组相比差异有显著性(P<0.01),单纯冻融抗原活化的CTL治疗组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。冻融抗原负载DC活化的CTL治疗组诱导凋亡的作用明显强于单纯冻融抗原活化的CTL治疗组,两者相比差异有显著性(P<0.01)。7流式细胞术检测治疗组中Fas膜蛋白的表达:冻融抗原负载DC活化的CTL治疗组中肿瘤细胞Fas膜蛋白的表达量不仅高于空白组,而且高于单纯冻融抗原活化的CTL治疗组,于这两组相比差异均有显著性(P<0.01)。单纯冻融抗原活化的CTL治疗组与空白组相比则无统计学差异(P>0.05)。8免疫组化检测Survivin在子宫内膜癌移植瘤组织中的表达:对照组肿瘤细胞染色为强阳性;冻融抗原活化的CTL组,染色为弱阳性;负载冻融抗原的DC活化的CTL组,肿瘤细胞大部分不着色,染色为阴性。结论:1 Ishikawa冻融抗原负载的DC活化的CTL比单纯冻融抗原活化CTL形成的集落大,且增殖快。表明DC能高效地递呈抗原,促进特异性T淋巴细胞的增殖。2 Ishikawa冻融抗原负载的DC活化的CTL能有效抑制裸鼠Ishikawa移植瘤的生长,且抑制作用与接种次数有关。3 Ishikawa冻融抗原负载的DC活化的CTL对于较小的裸鼠皮下移植瘤的治疗效果较大的移植瘤明显,表明树突状疫苗更适用于微小病变。4 Ishikawa冻融抗原负载的DC活化的CTL能够诱导Ishika- wa细胞凋亡。5 DC能够上调Ishikawa肿瘤细胞Fas膜蛋白的表达,这可能是诱导Ishikawa移植瘤细胞凋亡的机制之一。6 DC可能通过下调凋亡抑制基因Survivin的表达,诱导肿瘤细胞的凋亡。7 DC可能通过下调Survivin的表达,解除其高表达对促凋亡蛋白Fas表达的抑制作用,从而促进移植瘤细胞凋亡。8 Ishikawa冻融抗原负载的DC活化的CTL预防组的移植瘤发生率明显低于冻融抗原活化的CTL组和对照组。表明其在预防移植瘤发生中发挥作用。