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目的:通过针刺补泻跷脉穴位刺激失眠大鼠,观察大鼠行为学和睡眠实验变化,结合实时荧光定量PCR技术(RT-PCR),Western Blot技术(WB)、免疫组织化学染色法(IHC)、酶联免疫吸附实验(ELISA)技术,研究针刺对大鼠SCN内生物钟基因Clock、Per2 mRNA相对表达量,CLOCK、PER2 mRNA蛋白表达水平的调节,并观察Glu/GABA-Gln代谢环路的变化。由此探讨针刺调理跷脉治疗失眠的机制。方法:1.观察基于跷脉理论针刺对失眠SD大鼠基本情况的改变:48只雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组、西药组、针刺组,采用腹腔注射PCPA的方法复制失眠模型,西药组给予艾司唑仑溶液(0.08mg/ml)灌胃,0.558mg/kg,1天1次,连续五天,针刺组采用补照海、泻申脉的治疗方法,1天1次,连续5天。于造模前、造模后及干预后对各组大鼠的体重、24h二便量进行测量比较,观察其变化。2.观察基于跷脉理论针刺对失眠SD大鼠行为学的影响:分组、造模及干预情况同实验一,分别在造模前、造模后、治疗后进行水迷宫和旷场实验,对比造模前后、治疗前后大鼠的空间记忆能力、自发活动情况,观察其行为学变化。3.观察基于跷脉理论针刺对失眠SD大鼠睡眠实验的影响:分组、造模及干预情况同实验一,分别在造模后、治疗结束后,对4组大鼠进行戊巴比妥钠协同镇静催眠实验,观察各组在阈上剂量、阈下剂量的睡眠潜伏期和睡眠时间,对比各组数据,观察造模情况以及西药、针刺对睡眠实验的影响。4.观察基于跷脉理论针刺对失眠SD大鼠SCN内Per2、Clock基因和Glu/GABA-Gln代谢环路的影响:分组、造模及干预情况同实验一,在治疗干预结束后,将各组大鼠随机抽取一半,取下丘脑并剥离SCN,应用PCR、WB、ELISA、IHC技术观察SCN内Per2 mRNA、Clock mRNA相对表达量,PER2、CLOCK蛋白含量,检测下丘脑内GABA、Glu、GAD、GS含量;各组剩余大鼠,行大脑灌注后,应用IHC技术,观察下丘脑内GABAA的阳性表达率。结果:1.基于跷脉理论针刺对失眠SD大鼠基本情况的影响(1)造模前各组大鼠体重、24h二便量差异无统计学意义(p>0.05)。(2)体重方面:与空白组比较,造模后大鼠体重增长缓慢,差异无统计学意义(p>0.05);与模型组比较,针刺、西药治疗可以减缓这种趋势,使大鼠体重增加,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)二便方面:与空白组比较,造模可以增加大鼠24h二便量,其差异有统计学意义(p<0.05);与模型组比较,针刺和西药治疗,可以减轻造模带来的影响,使大鼠二便量趋向正常水平,其差异有统计学意义(p<0.05)2.基于跷脉理论针刺对失眠大鼠行为学的影响(1)造模前各组大鼠在空间记忆能力、自发活动方面水平一致,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)水迷宫实验:与空白组比较,造模后大鼠在目标象限进入次数、目标象限进入次数百分比、目标象限滞留时间、目标象限滞留时间百分比方面均下降,差异有统计学意义(p<0.05);与模型组比较,针刺和西药治疗后,目标象限进入次数、目标象限进入次数百分比、目标象限滞留时间、目标象限滞留时间百分比方面均趋向正常组,但只有目标象限进入次数间的差异有统计学意义(p<0.05)。(3)旷场试验:与空白组比较,造模后,大鼠站立次数明显增加,其差异有统计学意义(p<0.05),大鼠静止时间增加,运动时间减少,大鼠运动距离减少,但其差异无统计学意义(p>0.05);与模型组比较,西药组和针刺组大鼠站立次数减少,大鼠静止时间减少,运动时间增加,差异有统计学意义(p<0.05),运动距离增加,差异无统计学意义(p>0.05)。3.基于跷脉理论针刺对失眠大鼠睡眠实验的影响(1)造模对SD大鼠睡眠实验的影响:戊巴比妥钠协同镇静实验:与空白组比较,模型组、西药组、针刺组大鼠睡眠潜伏期延长、睡眠时间减少,差异有统计学意义(p<0.05)。戊巴比妥钠协同催眠实验:与空白组比较,模型组、西药组和针刺组大鼠睡眠潜伏期延长,睡眠时间减少,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)针刺对SD大鼠睡眠实验的影响:戊巴比妥钠协同镇静实验:与空白组比较,模型组大鼠睡眠潜伏期延长,其差异有统计学意义(p<0.05),经过干预后,西药组和针刺组大鼠睡眠潜伏期缩短,与模型组比较差异有统计学意义(p<0.05),与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05);与空白组比较,模型组大鼠睡眠时间减少,差异无统计学意义(p>0.05),与模型组比较,针刺组大鼠睡眠时间增加,但差异无统计学意义(p>0.05),西药组大鼠睡眠时间增加显著,高于空白组,差异有统计学意义(p<0.05)。戊巴比妥钠协同催眠实验:与空白组比较,模型组大鼠睡眠潜伏期显著增加,其差异有统计学意义(p<0.05);与模型组比较,西药组、针刺组大鼠睡眠潜伏期缩短,但其差异无统计学意义(p>0.05);与空白组比较,西药组和针刺组大鼠睡眠潜伏期仍较长,其差异有统计学意义(p<0.05);与空白组比较,模型组大鼠睡眠时间减少,但其差异无统计学意义(p>0.05);与模型组比较西药组、针刺组大鼠睡眠时间显著增加,其差异有统计学意义(p<0.05),与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。4.基于跷脉理论针刺对失眠SD大鼠SCN内Per2、Clock基因和Glu/GABA-Gln代谢环路的影响(1)下丘脑ELISA检测结果显示:与空白组比较,模型组大鼠下丘脑内GABA浓度下降,Glu浓度升高,差异有统计学意义(p<0.05);西药组、针刺组大鼠下丘脑内GABA浓度升高,Glu浓度降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)下丘脑GABAA免疫组化结果显示:与空白组比较,模型组大鼠下丘脑内GABAA阳性表达较多,MD水平升高,差异有统计学意义(p<0.05);西药组、针刺组大鼠下丘脑内GABAA阳性表达较少,MD较模型组降低,与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。(3)WB检测结果显示:与空白组比较,模型组大鼠SCN内CLOCK、PER2蛋白表达下降,差异有统计学意义(p<0.05);经治疗后西药组、针刺组大鼠SCN内CLOCK、PER2蛋白表达高于模型组,与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。与空白组比较,模型组大鼠下丘脑内GAD蛋白表达水平下降、GS蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(p<0.05);西药组、针刺组大鼠下丘脑内GAD蛋白表达水平升高、GS蛋白表达水平下降,与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。(4)RT-PCR检测结果显示:与空白组比较,模型组大鼠SCN内Clock mRNA,Per2 mRNA相对表达量下降,差异有统计学意义(p<0.05);经治疗后,西药组和针刺组大鼠SCN内Clock mRNA,Per2 mRNA相对表达量上升,与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:1.针刺调理跷脉能够有效缩短入睡潜伏期、延长睡眠时间。2.针刺调理跷脉可以有效缓解失眠对体重和二便的影响,起到稳定体重,保持二便量正常的作用。3.针刺调理跷脉可以有效缓解失眠对大鼠空间记忆能力和自发活动的影响,使之恢复正常。4.针刺调理跷脉可以升高大鼠SCN内Clock mRNA、Per2 mRNA相对表达量,CLOCK、PER2蛋白表达水平;提高下丘脑内GABA浓度、GAD蛋白表达水平,降低Glu浓度、GS蛋白表达水平、GABAA阳性表达水平。5.针刺调理跷脉治疗失眠的机制可能与调节核心生物钟基因,并对其下游的Glu/GABA-Gln代谢环路产生影响有关。