目的失眠作为现代社会的常见疾病,严重影响着人们的生活质量。中西医治疗失眠均着眼于镇静催眠,然而西医存在明显副作用并且长期疗效证据不足,中医方药众多并且疗效证据不足。临床上失眠的反复发作与异常情绪常相互伴随,并且一些针对失眠的方药研究显示从肝论治失眠确有疗效,提示从肝论治失眠具有一定的临床可行性。本研究首先从中医病机和西医发病的角度为从肝论治失眠寻找理论基础,之后一方面采用系统评价手段分析从肝论治失眠的临床有效性,为从肝论治失眠寻找临床证据；一方面采用电生理和分子生物学手段分析从肝论治方治疗失眠的作用靶点,为从肝论治失眠寻找实验室证据。最终使从肝论治失眠理论应用于临床有据可依。方法1文献研究研究一：全面检索从肝论治失眠的临床研究文献,建立从肝论治失眠随机对照临床试验、半随机对照临床试验、自身前后对照试验、病例报告、病例分析文献的数据库。统计近20年每年临床研究各设计类型的数量。研究二：选取研究一数据库中的从肝论治失眠随机对照临床试验和半随机对照临床试验,制作资料提取表以采集基本信息、设计类型、研究对象、干预措施、结局指标等文献信息,并采用Cochrane偏倚风险评价工具评价文献质量。研究三：根据伴随精神性疾病、中医证型、干预及对照措施、结局指标将研究二中纳入的文献划分为不同亚组,并采用RevMan5.0软件在异质性允许的条件下对从肝论治失眠疗效进行meta分析。研究四：选取研究一数据库中的从肝论治失眠自身前后对照试验,制作资料提取表以采集基本信息、设计类型、研究对象、干预措施、结局指标等文献信息。根据伴随精神性疾病、中医证型、结局指标将纳入文献划分为不同亚组,并采用RevMan5.0软件在异质性允许的条件下对从肝论治失眠疗效进行meta分析。2实验研究研究一：以空白血清为对照,采用HPLC测定从肝论治方四逆散含药血清的固有成分,并比较4个不同批次含药血清的成分差异。研究二：根据Springer protocol,采用新生24h内SD大鼠培养皮层神经元,倒置相差显微镜下观察神经元生长状态,并采用免疫荧光技术对培养12d的细胞进行神经元鉴定。研究三：原代培养SD大鼠皮层神经元培养至第7-12d,分别加入对照组血清、四逆散组血清,使血清终浓度为10%,继续培养3h和24h后,采用全细胞膜片钳技术记录各组GABA诱导的IGABA,描绘浓度-效应曲线、计算IGARA衰减时间常数。研究四：原代培养SD大鼠皮层神经元培养至第7-12d,分别加入对照组血清、四逆散组血清、归脾汤组血清,使血清终浓度为10%,继续培养24h后分别提取细胞膜蛋白及总蛋白。采用western blot技术检测各组蛋白质中GABA.受体α1、α2、α3、α5亚基的含量。结果1文献研究研究一：最终纳入977篇从肝论治失眠临床研究文献,其中随机对照临床试验占17.81%,半随机对照临床试验占1.23%,自身前后对照试验占5.42%。从肝论治失眠临床研究文献发表数量从1993年的9篇逐渐增多至2013年的103篇,其中,随机/半随机对照临床试验从2003年的4篇增至2013年的28篇,同比增幅达600%。研究二：最终纳入186篇从肝论治失眠随机/半随机对照临床试验文献,研究对象的年龄、性别、伴随疾病、证型分布以及干预措施、结局指标的选择可以良好的代表临床上的失眠患病人群,外部真实性良好。从随机分配方法、分配方案隐藏、盲法应用、结局损耗四方面判断,93.55%的文献存在高偏倚风险,内部真实性较差研究三：(1)伴有更年期失眠：肝郁气滞证、肝阴亏虚证从肝论治组量表评分低于西药组或从他脏论治中药组。(2)伴有亚健康失眠：肝郁气滞证、肝郁化火证从肝论治组量表评分低于西药组或安慰剂组。(3)伴有抑郁症失眠：无特定证型从肝论治组量表评分低于西药组。(4)伴有焦虑症失眠：无特定证型从肝论治组量表评分低于从他脏论治中药组。(5)原发性失眠：无特定证型从肝论治中药组或联合西药组量表评分低于西药组、从他脏论治中药组或安慰剂组；肝郁气滞证从肝论治组量表评分低于西药组或从他脏论治中药组；肝郁化火证从肝论治组中药或联合西药组量表评分低于西药或从他脏论治中药组；肝阴亏虚证从肝论治组量表评分低于西药组或从他脏论治中药组。(6)未知伴随精神性疾病失眠：肝郁气滞证、肝郁化火证从肝论治组量表评分低于西药组或从他脏论治中药组。研究四：最终纳入111篇从肝论治失眠自身前后对照试验文献,研究对象的年龄、性别、伴随疾病、证型分布以及干预措施、结局指标的选择可以良好的代表临床上的失眠患病人群,外部真实性良好。内部真实性无法判断。与治疗前相比,各亚组从肝论治后量表评分均显著降低。2实验研究研究一：4份四逆散含药血清的9个特有共有峰的相对保留时间RSD均在1%以内,相关系数均在0.90以上,证明不同批次血清成分比较稳定。但相对峰面积RSD最高达61.041%,证明不同批次血清成分含量存在差异。研究二：采用classⅢβ-Tubulin抗体进行神经元鉴定显示原代培养皮层神经元纯度较高。显微镜观察提示神经元培养至7-12d活性最好,细胞胞体饱满,光晕明显,分布均匀,神经网络初步形成,适宜进行膜片钳实验。研究三：经四逆散含药血清孵育后：(1)可增强GABA与GABAA受体的亲和力,随着孵育时间的延长,该作用有所减弱,但GABAA受体对低浓度GABA的敏感性有所增强。(2)可延缓GABAA受体进入失活。但随着孵育时间的延长,该作用有所减弱。(3)皮层神经元细胞膜上GABAA受体的数目增多,并随着孵育时间的延长,该作用有所增强。研究四：(1)经四逆散含药血清孵育后,皮层神经元总蛋白中α1亚基含量显著升高,α5亚基含量显著下降；皮层神经元膜蛋白中α2、α3亚基含量显著升高,α5亚基含量显著下降。(2)经归脾汤含药血清孵育后,皮层神经元总蛋白中α1亚基含量显著升高；皮层神经元膜蛋白中α1、α3亚基含量显著升高,α5亚基含量显著下降。(3)皮层神经元膜蛋白中α1、α2亚基含量四逆散组和归脾汤组之间存在显著性差异。结论1文献研究与对照组和治疗前相比,从肝论治失眠部分结局指标改善具有统计学意义。但由于文献方法学质量较低；干预措施方案不统一；结局指标中定性指标标准模糊客观性欠佳,定量指标在计算显效、无效的患者例数时标准不一,甚至未进行计算,无法进行进一步的分类变量合并效应量检验,最终均影响亚组meta分析结果临床意义的解释。要证实从肝论治失眠的临床有效性,尚需开展更多高质量的多中心、大样本随机临床对照试验。2实验研究从肝论治方通过增强GABAA受体对GABA的亲和性；延缓GABAA受体的失活；提高细胞膜上GABAA受体的表达,增强GABAA受体介导的mIPSP,起到神经元抑制,从而可能改善失眠。从肝论治方通过增加神经元总蛋白中α1亚基含量起到镇静催眠作用；通过增加神经元膜蛋白α2、α3亚基含量起到抗异常情绪作用；通过降低神经元总蛋白和膜蛋白中α5亚基含量避免记忆损害。与所隶属课题中的整体实验和临床试验结果相互印证,从不同角度证实从肝论治方治疗失眠的有效性。