人感染H7N9亚型禽流感病毒于2013年在中国长三角地区首次报道,可引起严重的下呼吸道感染症状。由于病毒每年持续广泛流行于该区域的家禽中,会在一定范围内感染人类,所以成为人们广泛关注的公共卫生问题。截至2017年5月28日,已有1514例人感染H7N9禽流感的实验室确诊病例。2016年底的第五波流行中,在家禽和人中同时检测到了高致病性H7N9病毒的存在,病毒HA抗原发生了变化。简便、高效的病原快速诊断和治疗策略有助于及时采取防控措施以控制疫情扩散,并使患者及时获得抗病毒治疗以改善预后。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是流感病毒表面重要的抗原之一,以四聚体形式存在,它能够切割唾液酸受体,帮助新生病毒颗粒释放和传播。NA单体分为胞内区、跨膜区、茎部区和头部区四部分,头部含有抗原表位和酶活性位点,在体内可作为抗原诱导体液免疫应答,产生抗体。靶向NA的抗体在体内和体外具有保护作用,部分抗体能够抑制神经氨酸酶活性,通过空间干扰等方式作用于NA,从而减轻流感病毒感染时的临床症状。本研究利用杂交瘤技术制备了多株针对H7N9流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的单克隆抗体,并对这些单克隆抗体的功能特性进行了鉴定;基于单抗的特性,又利用其中两株N9特异性单抗3C1和3E9,建立了双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)捕获N9亚型禽流感病毒抗原的特异性快速检测方法,为H7N9禽流感病毒的诊断和防控提供了一个良好的材料。本课题研究结果如下:一、抗H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶单克隆抗体的制备及鉴定1.通过小鼠免疫、细胞融合以及间接ELISA筛选方法得到25株H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶特异性单克隆抗体。2.25 株单抗分别与 rgH6N2、rgH6N9、rgH9N2 及 A/Environment/Jiangxi/28/2009(H1 1N9)病毒进行神经氨酸酶抑制实验。重组病毒rgH6N2、rgH6N9、rgH9N2的NA分别来自 A/Brisbane/10/2007(H3N2),A/Anhui/1/2013(H7N9)以及 A/Hong Kong/33982/2009(H9N2)。25株抗体对rgH6N9、H11N9、rgH9N2和rgH6N2的神经氨酸酶抑制活性不同,22 株对 rgH6N9 和 H11N9 的 IC50 为<1.6～>100μg/ml;对 rgH9N2 的 IC50 为15～>100μg/ml,对 rgH6N2 则完全没有抑制,IC50 都>100μg/ml。3.从25株单抗中挑选3株单抗(1G8、3C4和4E8)进行了详细的功能鉴定,三株单抗为Anhui/1-N9识别特异性的;3C4和4E8具有神经氨酸酶抑制活性,IC50分别为1.45μg/ml 和 8.65μg/ml;竞争 ELISA 显示三株抗体对 A/Anhui/1/2013(H7N9)的 N9蛋白的结合表位各不同。二、禽流感病毒N9抗原检测方法的建立1.通过荧光标记抗体配对平台筛选出2株单抗(3C1和3E9)用于组建基于双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)的N9抗原检测方法。2.DAS-ELISA对N9抗原的检测表现出高敏感性。用重组病毒rgH6N9、野生型病毒A/Environment/Jiangxi/28/2009(H11N9)以及重组 N9 蛋白对 DAS-ELISA 的灵敏度进行了测试,系统对rgH6N9和H11N9的最低检测阈值为0.125血凝单位/50μl;N9标准曲线呈线性反应关系,最低检测限为6.25ng/ml。3.用重组病毒rgH6N1、rgH6N2以及rgH9N2对DAS-ELISA的特异性进行了测试,当固定病毒用量都为8血凝单位/50μl时,检测不出任何阳性信号,表现出高特异性。4.使用咽拭子样本评估DAS-ELISA在临床应用的可行性。DAS-ELISA检测五份Q-PCR确诊的H7N9样本,两份显示阳性信号;同时用商品化H7亚型流感病毒检测试剂盒(胶体金法)检测样本,全部未检出阳性信号。结论1.制备获得25株N9特异性单克隆抗体,其中22株显示出神经氨酸酶抑制活性,IC50 为<1.6～15μg/ml。2.用N9特异性抗体组建了双抗体夹心ELISA法,表现出高敏感性和特异性,可用于检测H7N9病毒或N9蛋白和临床样本。