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本文分为以下几个部分进行探讨: 第一部分 人类HD结肠巨噬细胞分布和活化及ICCs表型改变 目的:检测HD患儿结肠组织中巨噬细胞分布活化及ICCs表型的改变,探讨巨噬细胞在HD肠炎发病中的作用。 方法:收集先天性巨结肠患儿结肠远段及近段标本,行HE染色、评估各段肠管炎症损伤程度,CD68和iNOS免疫荧光双染法评估M1型巨噬细胞活化状况,CD68和Arg-1免疫荧光双染法评估M2型巨噬细胞活化状况,c-kit免疫组化染色观察ICCs表型改变,Western Blot、RT-PCR检测各组肠管iNOS、TNF-α、IL-1β、Arg-1、CD34、c-kit的蛋白及mRNA表达水平。 结果:HE染色显示HAEC组结肠近端扩张段粘膜层、粘膜下层有明显的炎症细胞浸润,结肠组织病理评分显示HAEC结肠扩张段评分明显高于HAEC结肠远段及HD结肠近段、远端。CD68和iNOS免疫荧光双染可见HAEC组结肠扩张段M1型巨噬细胞明显增多,而HAEC组结肠远段及HD组结肠近段、远端未见明显的M1型巨噬细胞;CD68和Arg-1免疫荧光双染可见,与HAEC及HD结肠近端扩张段相比较, M2型巨噬细胞在HAEC及HD组结肠远段均增加。c-kit免疫组化染色显示,相对比HD组结肠近段,HAEC组结肠扩张段c-kit阳性的ICCs明显减少;而HD及HAEC结肠远段均未见明显的ICCs表达。Western Blot显示HAEC组结肠扩张段iNOS、TNF-α、IL-1β表达升高,Arg1表达在HD及HAEC远端升高,c-kit表达在HAEC组结肠扩张段降低(p<0.05),而CD34在各组的表达变化均不明显。RT-PCR结果显示iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平在HAEC组结肠扩张段明显升高,同时c-kit表达降低(p<0.05),CD34在各组的表达变化均不明显。 结论:HAEC组结肠近端扩张段M1型巨噬细胞浸润明显并且分泌的大量的炎症因子如TNF-α、IL-1β,同时ICCs的c-kit表达明显降低。 第二部分 HD模型小鼠(Ednrb-/-)结肠巨噬细胞活化及对ICCs表型改变和肠道慢波的影响 目的:检测不同周龄HD模型小鼠(Ednrb-/-)结肠结肠组织巨噬细胞活化及ICCs表型和肠道慢波活动的改变,探讨巨噬细胞活化对ICCs表型改变及肠道慢波活动的影响。 方法:获取1w、2w、3w周龄的HD小鼠及野生型小鼠的结肠标本,结肠HE染色、评估各段肠管炎症损伤程度,CD68和iNOS免疫荧光双染法评估M1型巨噬细胞活化状况,CD68和Arg-1免疫荧光双染法评估M2型巨噬细胞活化状况,c-kit免疫组化染色观察ICCs表型改变,Western Blot、RT-PCR检测各组肠管iNOS、TNF-α、IL-1β、Arg1、CD34、c-kit的蛋白及mRNA表达水平,电生理记录仪检测各组小鼠结肠慢波活动变化。采用氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞后再检测巨噬细胞活化状态、ICCs表型及结肠慢波活动。 结果:HE染色显示3w的HD小鼠结肠近端扩张段有大量的炎症细胞浸润,结肠组织病理评分显示3w的HD小鼠结肠近段评分明显高于其结肠远段及1w、2w的HD结肠近段、远端。CD68和iNOS免疫荧光双染可见3w的HD小鼠结肠近段M1型巨噬细胞明显增多,而其结肠远段及1w、2w的HD小鼠及野生型小鼠结肠近段、远端未见明显的M1型巨噬细胞;CD68和Arg1免疫荧光双染可见,与HD结肠近段及野生型小鼠相比较,M2型巨噬细胞在3w的HD小鼠结肠远段增加。c-kit免疫组化染色显示,相对比于1w、2w的HD小鼠及野生型结肠近段,3w的HD小鼠结肠近端扩张段c-kit阳性的ICCs明显减少;而1w、2w及2w结肠远段均未见明显的ICCs表达。Western Blot显示3w的HD小鼠结肠近端扩张段iNOS、TNF-α、IL-1β表达升高,Arg1表达在1w、2w及3w的HD小鼠远端升高,c-kit表达在3w的HD小鼠结肠扩张段降低(p<0.05),而CD34在各组的表达变化均不明显。RT-PCR结果显示iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平在HAEC组结肠扩张段明显升高,同时c-kit表达降低(p<0.05),CD34在各组的表达变化均不明显。电生理记录仪显示,1w、2w的HD小鼠肠道慢波振幅降低,但存在正常的节律及频率;而3w的HD小鼠结肠慢波紊乱、破坏。氯膦酸二钠脂质体处理后,3w的HD小鼠结肠近段未见明显的炎症损伤,CD68及iNOS的免疫荧光双染未见明显的巨噬细胞浸润,同时可见c-kit阳性的ICCs,肠道慢波活动有所恢复。 结论:HAEC结肠扩张段M1型巨噬细胞活化及分泌的炎症因子改变ICCs的表型进而抑制肠道慢波活动。 第三部分 TNF-α对肠道ICCs表型及起搏电流的影响 目的:提取小鼠结肠ICCs,TNF-α刺激后检测ICCs表型及起搏电流的变化。 方法:采用酶消化法提取3周龄野生型小鼠的ICCs,培养3天后实验组加入10ng/ml的TNF-α共培养,对照组加入等量的生理盐水,再培养24小时后,采用CD34及c-kit免疫荧光双染法检测ICCs表型改变,RT-PCR法检测CD34、c-kit及与起搏电流相关的基因如Ryr3、Itpr3、Calm1、TRPC4、Ano1、DIG2、DIG4表达,膜片钳技术记录全细胞起搏电流变化。 结果:光镜下可见实验组ICCs单个细胞及细胞网格间的突触数量减少;免疫荧光染色可见实验组c-kit表达明显减少,而CD34未见明显变化;RT-PCR结果显示CD34的mRNA表达水平无明显变化,而c-kit的表达明显降低,同时Ryr3、Itpr3、TRPC4、Ano1的表达也下调,但Calm1、DIG2、DIG4的表达无明显改变;膜片钳记录ICCs起搏电流显示,实验组起搏电流幅度明显降低。 结论:TNF-α能抑制ICCs的c-kit及其下游与起搏电流相关基因的表达,进而抑制ICCs起搏电流的幅度。 第四部分 LPS诱导的斑马鱼肠炎中ICCs表型改变及其机制研究 目的:探讨LPS诱导的斑马鱼肠炎中,miR221表达及对Cajal表型改变和肠道蠕动功能的影响。 方法:对照组采用egg water饲养,实验组自斑马鱼胚胎发育的48hpf至11dpf使用不同浓度LPS(1、10、50μg/ml)配制的egg water持续喂养。收集3dpf、5dpf、7dpf,11dpf时间段的斑马鱼标本。HE染色评估肠道组织炎症损伤程度,RT-PCR检测斑马鱼组织miR221表达,Western Blot及RT-PCR检测TNF-α、c-kit蛋白及mRNA的表达,whole-mount制备组织免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜下观察斑马鱼肠道c-kit表达,荧光示踪剂法检测斑马鱼肠道传输速率。自斑马鱼受精卵的0.2-1h内,显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸链抑制miR221(MO-miR221)及错配的吗啡啉修饰的寡核苷酸链(Mismatch-MO),按上述方法用LPS刺激斑马鱼,收集不同时间点斑马鱼标本,检测c-kit表达及斑马鱼肠道传输速率。 结果:HE染色显示,LPS刺激后,3dpf、5dpf、7dpf、11dpf的斑马鱼肠道组织均有不同程度的炎症损伤,并且LPS浓度越高,肠道炎症损伤越为明显。Western Blot检测TNF-α蛋白水平显示,3dpf,5dpf,7dpf,11dpf组其表达水平随LPS浓度增加而表达均呈上调趋势(P<0.05),并且呈现LPS浓度依耐性;而kita的表达呈现下降趋势(P<0.05)。RT-PCR检测TNF-α的mRNA表达显示,各时间段其表达水平随LPS浓度增加而表达均呈上调趋势(P<0.05);而kita的表达呈现下降趋势(P<0.05)。免疫荧光染色显示,3dpf,5dpf各组未见明显的c-kit表达,而7dpf,11dpf组c-kit表达水平随着LPS浓度的增加而下降。荧光示踪剂检测肠道传输速率显示,7dpf,11dpf组肠道传输速率随着LPS浓度的增加而下降。Targetscan软件预测发现miR221能够与kita互补进而抑制其表达,同时RT-PCR检测miR221发现其表达水平随着LPS浓度增加而升高。分别显微注射 Mismatch-Mo和 miR221-MO后, RT-PCR证实miR221-MO组LPS刺激后3dpf、5dpf、7dpf时能有效抑制miR221的表达(P<0.05);同时用 RT-PCR检测3dpf、5dpf、7dpf时斑马鱼 kita的 mRNA表达发现,与Mismatch-MO相比较,LPS刺激后miR221-MO组kita表达水平较高(P<0.05),免疫荧光染色染色发现miR221-MO组LPS刺激后kita表达有恢复,并且荧光示踪剂显示7dpf的miR221-MO组肠道传输速率升高。而11dpf时,miR221表达随LPS浓度递增而下降,同时kita表达水平下降,肠道传输速率亦下降,表明miR221-MO抑制效果消失。 结论:LPS刺激斑马鱼后诱导TNF-α的分泌能上调miR221进而抑制肠道kita表达及肠道传输速率。