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目的有机磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)是一类用途广泛、种类繁多的化学品,主要用作杀虫剂、塑化剂、润滑剂、添加剂以及战争毒剂等。有机磷化合物不但可以引起急性中毒,部分有机磷化合物还能在人和敏感动物引起一种严重的、不可逆的迟发性神经损害——有机磷酸酯诱导的迟发性神经病(organophosphorus ester induced delayed neuropathy, OPIDN)<三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate TOCP)是第1个被确认的能引起迟发性神经毒性的有机磷化合物。到目前为止,国内外学者对OPIDN的研究已经超过1个世纪,然而OPIDN的发病机制仍不清楚,因此临床上对OPIDN缺乏有效的防治措施,预后较差。本研究以大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)染毒TOCP,建立OPIDN离体细胞模型,研究TOCP染毒后PC12细胞自噬活性和自噬相关蛋白的变化,以及自噬相关蛋白变化的可能机制,从有机磷神经毒物干扰神经元自噬角度探讨OPIDN的发生机制,为OPIDN防治提供科学依据。方法1MTT法确定TOCP对细胞增殖的抑制作用浓度范围2TOCP染毒细胞模型和药物干预模型的建立常规方法培养PC12细胞至对数期后染毒TOCP,分别研究TOCP对自噬活性影响的剂量-反应关系和时间-反应关系。剂量-反应关系研究的具体分组：设0、0.05、0.10、0.25、0.50mM TOCP5个组,染毒24h；时间-反应关系研究的具体分组：利用0.05mM浓度的TOCF染毒细胞,设0、6、12、24、48h5个观察点,并收集细胞。在药物干预实验中,提前20min分别给予苯甲基磺酰氟(PMSF)、calpain特异性抑制剂(ALLN)和caspase抑制剂(Ac-DEVD-CHO),再染毒TOCP,然后研究干预药物对TOCP引起的自噬活性变化的影响(包括剂量-反应关系和时间-反应关系)。3形态学观察荧光显微镜观察,利用MDC染色观察PC12细胞中的自噬体的形成,利用免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达。4自噬相关蛋白含量的检测取染毒或干预后的细胞,经细胞裂解液处理后,4℃12000*g离心10min,取上清,BCA法进行蛋白定量,Western-blotting技术检测细胞中自噬相关蛋白表达的变化。结果1MTT法结果显示,随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长,TOCP对大鼠嗜铬神经瘤细胞PCI2增殖有抑制作用。2MDC染色试验发现TOCP染毒后PC12细胞自噬体数量显著减少,且自噬体数量与TOCP染毒浓度和TOCP作用时间呈负相关。3免疫荧光观察发现TOCP染毒细胞后显著影响了Beclin-1和p62蛋白的表达。随着TOCP染毒剂量的增加或者染毒时间的延长,Beclin-1蛋白的橙红色荧光逐渐减弱,而p62蛋白的黄绿色荧光逐渐增强。应用PMSF和ALLN抑制剂分别干预后,再重复上述试验,则发现Beclin-1蛋白的橙红色荧光表达增强,而p62蛋白的黄绿色荧光强度则不同程度地减弱。4Western-blotting技术检测发现,随着TOCP染毒浓度的增高,Beclin-1、 UVRAG、LC3和pro-caspase-3的含量均出现下降,而p62、μ-calpain以及活化的caspase-3含量则有不同程度增加,并呈现明显的剂量-反应关系(P<0.05)。同时,随着TOCP染毒时间的延长,TOCP染毒显著抑制了自噬相关蛋白Beclin-1、 UVRAG、LC3以及pro-caspase-3的水平,增加了p62、μ-calpain和活性caspase-3的水平,并呈现出明显的时间-反应关系(P<0.05)。5提前给予PMSF、Calpain抑制剂以及Caspase抑制剂,再染毒TOCP, Western-blotting结果显示3种抑制剂均不同程度上抑制了TOCP诱导的自噬相关蛋白Beclin-1、UVRAG、LC3以及p62的变化和caspase的激活。结论1TOCP染毒PC12细胞后引起了细胞自噬活性的降低。2TOCP染毒干扰了PC12细胞中自噬相关蛋白Beclin-1、UVRAG、LC3、 p62、 calpain以及caspase-3的表达。3PMSF、Calpain抑制剂以及Caspase抑制剂预处理均能不同程度地预防TOCP诱导的PC12细胞自噬活性的下降和自噬相关蛋白的变化。4Calpain和Caspase-3激活引起的神经细胞自噬活性变化可能涉及到OPIDN的发病机制。