绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在昆虫的生物防治中起着重要作用。病原真菌主要以孢子侵染昆虫，菌株的产孢能力是菌株选育中的重要参数。迄今为止，关于杀虫真菌农药生产直接相关的产孢机制的研究不多，而关于微循环产孢相关的基因的研究尚未报道。本实验曾研究表明金龟子绿僵菌CQMa102在一定的培养条件下能够进行微循环产孢。微循环产孢在产孢速度和产孢总量上明显优于正常产孢。本实验室构建了金龟子绿僵菌CQMa102微循环产孢时期的差减文库，在此基础上，我们选择了金龟子绿僵菌CQMa102微循环产孢时期高表达的编号为C6-3的EST序列，Genebank中的登录号为FC809355，该EST序列长222bp，该基因和粗糙脉胞菌的clock-controlled gene-6具有较高的同源性，利用本实验室构建的金龟子绿僵菌CQMa102微循环产孢时期的均一化全长cDNA文库，获取了该微循环产孢相关基因(Mmc)的cDNA全长；利用本实验室构建的金龟子绿僵菌CQMa102基因组DNA文库，成功获取了Mmc基因的DNA全长；利用RNAi的方法研究了Mmc的功能。主要研究结果如下：　　 1.获取了Mmc基因的cDNA全长，并进行了生物信息分析。Mmc基因cDNA片段全长848bp，包括一个450bp的开放阅读框，102bp的5UTR，296bp的3UTR。cDNA序列的Genebank登录号为FJ827121。预测该基因编码149个氨基酸，同粗糙脉胞菌clock controlled protein-6(ccg-6)具有较高的同源性，E-Value值为2e-38。推测含有信号肽，其序列为MKYTAALIAAAVGANAFA，其切割位点位于ANAFA-KNVTYV之间。　　 2.生物信息学分析结果表明，该蛋白具有三个跨膜区域，分别位于3-21、68-89、131-149位，在57位氨基酸处(TITD)有一个酪蛋白激酶2磷酸化位点，在134位(SGAG)有一个氨基葡聚糖结合位点，在20位(NVTY)，91位(NSTV)分别有一个N-糖基化位点，在100位(GVYPTK)，126位(GAGKAA)，135位(GAGLAG)分别具有一个十四烷基位点预测其分子量为14.8kDa，等电点为8.30。　　 3.利用本实验室构建的金龟子绿僵菌CQMa102基因组DNA文库，通过菌落原位杂交的方法，获取了Mmc基因的DNA全长。将DNA序列与cDNA序列用b12seq软件比对，结果表明：Mmc基因DNA全长1059bp，含有两个内含子，其中一个内含子(259bp-416bp)具有典型的GT.....AG边界，另一个内含子(499bp-551bp)的边界为GG....GC。该DNA序列的Genebank登录号为：FJ827120。　　 4.利用RNAi的方法对Mmc基因的功能进行研究。干扰片段连接至RNA干扰载体(pbar-RNAi-gpd-trp)后，基因枪法转化金龟子绿僵菌CQMa102，经过PCR筛选，获得3个Mmc基因的干扰突变株，并用定量PCR的方法检测干扰突变株中Mmc基因的表达量。结果表明，干扰突变株的干扰效率在30％-60％之间，其中3号干扰突变体的干扰效率最低，达到37％。　　 5.分析了3号干扰突变株在微循环产孢培养基上的产孢形态和产孢量，在微循环产孢培养基SDY上，干扰突变株孢子仅有少数进行微循环产孢，而其余孢子则进行正常产孢，有大量白色的菌丝体出现。野生株的产孢量是干扰突变株的5.29倍。野生株的产孢速度是干扰突变株的3.18倍。然而在正常产孢的培养基1/4SDA上，野生株和干扰突变株的产孢量和产孢速度没有显著的差异。结果表明，Mmc基因是影响金龟子绿僵菌CQMa102的微循环产孢的特异基因。Mmc基因的干扰导致微循环产孢方式受到抑制而对正常产孢没有影响。　　 6.对干扰突变株孢子的抗逆境能力进行分析，干扰突变株抵抗干热和湿热的能力显著低于野生株，而抵抗UV-B的能力却和野生株没有显著差异。结果表明，Mmc基因调节金龟子绿僵菌CQMa102微循环产孢的同时也影响菌株的耐热能力却对菌株抵抗辐射的能力没有影响。　　 7.对干扰突变株孢子的毒力进行了测定，干扰突变株孢子的半致死时间和野生株孢子没有显著差异。说明Mmc基因的干扰没有影响到孢子的毒力，推测Mmc基因不影响金龟子绿僵菌CQMa102的毒力。