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目的燃煤型砷中毒是我国特有的一种地方性砷中毒病型,仅分布于贵州、陕西两省,患者除有典型皮肤病损外,尚具有严重的肝损伤,肝硬化是本型砷中毒死亡的主要原因之一。由于砷致病机制至今未明,燃煤型砷中毒肝损伤机制的研究成为该领域研究的热点。课题组前期研究发现,砷中毒肝损伤的发生、发展与氧化损伤和细胞凋亡有关,而具有调控细胞周期、细胞凋亡等功能的p53调控网络与砷毒作用机制有着密切联系。为了解砷致机体肝损伤与细胞凋亡和p53的关系,本研究充分利用贵州省特有的燃煤型砷中毒病型资源,从人群研究、动物实验和细胞实验三个体系,基因转录表达、蛋白表达及翻译后修饰三个水平,以肝脏为靶器官,探讨p53上游调控、p53表达及其介导的细胞凋亡通路在燃煤砷污染致肝损伤中的作用以及银杏叶片对其的干预作用,进而深入了解燃煤砷污染致机体肝损伤的机制,为地方性砷中毒的预防和治疗策略改进提供针对性依据。方法调查点及调查对象的选择:以贵州省兴仁县交乐村燃煤型砷中毒病区为调查点,依据《地方性砷中毒诊断标准》(WS/T 211-2001)选取207例病区居民为观察对象,将病区观察对象分为病区非病人组46例和病人组161例。参照《职业性中毒性肝病诊断标准》(GBZ 59-2010)将病人组分为无明显肝病组49例、轻度肝病组65例和中重度肝病组47例。在距病区约13 km的无燃用高砷煤史且生活习惯及经济状况与调查病区相似的大果朵村,选取经健康体检合格的64名居民纳入对照组。砷中毒大鼠模型及银杏叶片干预模型的建立:砷中毒大鼠模型建立:健康断乳Wistar大鼠24只,随机分为正常对照组,低砷、中砷和高砷粮食污染组。正常对照组喂以标准饲料,染砷组喂以掺入高砷煤烘玉米粉的饲料,饲料含砷量分别为25、50、100 mg/kg,持续3个月。银杏叶片干预模型建立:健康断乳Wistar大鼠24只,随机分为正常对照组、高砷粮食污染组、银杏叶片治疗组和单纯银杏叶片组。正常对照组喂以标准饲料4.5个月;高砷粮食污染组喂以含砷量为100 mg/kg的饲料3个月后,再以标准饲料喂饲1.5个月;银杏叶片干预组喂以含砷量为100 mg/kg的饲料3个月后,再以标准饲料喂饲1.5个月,喂饲标准饲料期间按25 mg/kg.bw灌胃给予银杏叶片,6 d/周。单纯银杏叶片组喂饲标准饲料3个月后,按25 mg/kg · bw灌胃给予银杏叶片,6 d/周,持续1.5个月,给药同时喂以标准饲料。亚砷酸钠致L-02细胞中毒模型及干预模型的建立:L-02细胞砷暴露模型建立:L-02细胞分别在含0、1、5、25、50和100μmol/LNaAs02的培养液中培养24h。L-02细胞抑制剂干预模型建立:分别用p53抑制剂PFTα、ATM/ATR抑制剂CGK733和银杏叶片对暴露于砷的L-02细胞进行干预。采用氢化物发生-电感耦合等离子发射光谱法(HG-ICP-OES)测定尿砷、毛发砷和肝砷含量。采用生物化学方法检测血清ALT、ChE、ALB、TBA和STB。采用HE染色观察肝脏病理形态学改变。采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测肝细胞凋亡。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测p53、Bax、Bcl-2、Fas和DR5 mRNA表达。采用免疫印迹(Western blotting)检测大鼠肝组织和L-02细胞 p-p53(ser20)、p53、p-Chkl(Ser345)、Chkl、Bax、Bcl-2、Fas 和 DR5 蛋白表达。结果人群研究结果:砷负荷检测结果显示,随肝病病情加重,人群尿砷、发砷含量逐渐增高,各病人组砷负荷明显高于对照组和病区非病人组。肝功能检查结果显示,轻度和中重度肝病组TBA显著高于对照组、病区非病人组和无明显肝病组;各病人组ALB、ChE显著低于对照组和病区非病人组;各组间ALT、STB差异无统计学意义。外周血p53介导的细胞凋亡通路相关基因mRNA检测结果显示,与对照组、病区非病人组和无明显肝病组比较,轻度和中重度肝病组Bax、DR5 mRNA相对表达量显著升高,而p53 mRNA相对表达量显著降低;各组间Bcl-2、Fas mRNA差异无统计学意义。动物实验结果:①燃煤型砷中毒大鼠肝损伤模型的建立:随染砷剂量增加,大鼠尿砷、毛发砷和肝砷含量逐渐增高,呈剂量-效应关系;与正常对照组比较,中砷、高砷粮食污染组TAB显著升高,高砷粮食污染组ALB和低砷、中砷、高砷粮食污染组ChE显著降低;肝组织病理学检查发现,各染砷组出现不同程度的肝细胞水肿、点状坏死或碎片状坏死、纤维结缔组织增生或炎细胞浸润。依据大鼠一般情况、生长抑制、体内砷负荷增加、肝功能异常及肝组织病理学改变,表明燃煤型砷中毒肝损伤模型构建成功。②细胞凋亡检测结果显示,随着染砷剂量增加,大鼠肝细胞凋亡率及凋亡细胞积分光密度升高,砷负荷、TBA与肝细胞凋亡率呈正相关,ALB、ChE与肝细胞凋亡率呈负相关,有明显剂量-效应关系,提示细胞凋亡是砷中毒大鼠肝损伤的原因之一。③RT-qPCR和Western blotting检测结果显示,随染砷剂量增加,大鼠外周血、肝组织p53mRNA及肝组织p-Chk1、p-p53、p53蛋白相对表达量升高,伴有外周血、肝组织Ba肽、DR5 mRNA及肝组织Bax、DR5、Fas蛋白相对表达量升高。Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现先升高再下降的趋势,但仅高砷粮食污染组肝组织Bcl-2 mRNA相对表达量显著低于正常对照组。银杏叶片干预实验结果:①银杏叶片可在一定程度上缓解砷对大鼠的毒性效应,改善肝功能。②采用银杏叶片治疗后,大鼠肝细胞凋亡率和凋亡细胞积分光密度下降;肝组织p53 mRNA、p-p53和p53蛋白相对表达量降低,伴Bax、DR5 mRNA和Bax、DR5、Fas蛋白相对表达量降低。体外细胞实验结果:①RT-qPCR结果显示,随染砷剂量增加,L-02细胞p53 mRNA相对表达量逐渐降低,25、50和100 μmol/LNaAsO2组p53mRNA相对表达量明显低于正常对照组,与人群研究结果一致;Western blotting结果显示,随染砷剂量增加,p-Chkl、p-p53、p53蛋白相对表达量呈现先升高再下降的趋势,与正常对照组比较,25、50 μmol/LNaAsO2组p-Chkl、p-p53蛋白相对表达量显著升高,1、5、25和50μ mol/L NaAs02组p53蛋白相对表达量显著升高。②随染砷剂量增加,L-02细胞Bax、DR5 mRNA和蛋白相对表达量升高,25、50、100μ mol/L NaAsO2组Bax和25、50 μ mol/L NaAsO2组DR5蛋白相对表达量明显高于正常对照组;Bcl-2 mRNA表达量虽然也随染砷剂量增加而逐渐增加,但各组Fas mRNA和Bcl-2、Fas蛋白相对表达量无明显差异。体外细胞干预实验结果:①采用 PFTα抑制 p53 转录活性后,L-02 细胞 Bax、Bcl-2、DR5mRNA 和 Bax、DR5蛋白相对表达量降低,显著低于砷暴露组,而p53 mRNA相对表达量升高;各组Fas mRNA和Bcl-2、Fas蛋白相对表达量无明显差异。②采用CGK733抑制ATM/ATR 活性后,L-02 细胞 Bax、Bcl-2、DR5 mRNA 和 Bax、DR5 蛋白表达量均降低,显著低于砷暴露组,而p53 mRNA相对表达量升高,各组Fas mRNA和Bcl-2、Fas蛋白相对表达量无明显差异。③采用银杏叶片干预后,L-02细胞Bax、Bcl-2、DR5 mRNA和Bax、DR5蛋白相对表达量均降低,显著低于砷暴露组,而p53 mRNA相对表达量升高,各组Fas mRNA和Bcl-2、Fas蛋白相对表达量无明显差异。结论砷可能通过激活p53上游ATR-Chkl信号通路使p53蛋白磷酸化,磷酸化p53累积并上调Bax、DR5 mRNA和蛋白表达水平,通过线粒体凋亡途径和死亡受体途径诱导细胞凋亡,p53介导的细胞凋亡可能是砷致肝损伤的原因之一。p53抑制剂PFTα和ATM/ATR抑制剂CGK733均可下调Bax、DR5 mRNA和蛋白表达水平,该结果反证了砷可通过ATR-Chkl促进p53蛋白磷酸化并诱导细胞凋亡的推论,为砷中毒肝损伤治疗提供了新的思路和方向。银杏叶片可能通过抑制ATR-Chkl-p53信号通路削弱砷对p53及其下游细胞凋亡通路的激活,从而抑制细胞凋亡,这可能是银杏叶片减轻肝损伤,改善肝功能的机制之一。