研究背景与研究目的股骨头坏死是由各种病因引起的股骨头血液供应障碍,从而导致骨细胞及骨髓成分缺血坏死,继而发生自身修复,最终造成股骨头结构改变、塌陷、关节功能障碍的一种疾病。有研究调查显示全世界股骨头坏死患者约2000万人,我国每年新发股骨头坏死患者约为10-20万例。近年有股骨头坏死病因学研究调查指出,中国特发性股骨头坏死患者数量占股骨头坏死患者总数的28.71%。激素在多种疾病的治疗过程中发挥着不可替代的作用,但是大量不规范应用激素的同时也会产生严重的并发症,比如激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH）,目前调查研究显示激素性股骨头坏死已经成为非创伤性股骨头坏死的主要类型。股骨头坏死致残率高,股骨头坏死患者如不早期进行及时干预或治疗,发展至晚期出现股骨头大面积塌陷坏死,引发剧烈疼痛,步行困难,即使进行股骨头置换,或多或少也会留下下肢运动或者感觉功能减退,留下后遗症,效果不好的患者甚至遗留残疾,为患者和社会带来了巨大的负担。因此,股骨头坏死的早期诊断和治疗就显得尤为重要。激素性股骨头坏死的发病机制众说不一,其发病机制学说有以下几种:血管内凝血学说、脂质代谢紊乱学说、细胞凋亡学说、骨髓间充质干细胞分化学说、骨质疏松学说、骨内高压学说等。目前认为激素性股骨头坏死是多种因素共同作用的结果,因此,改善股骨头局部血液循环、促进骨形成、改善凝血状态、调节脂代谢紊乱、抑制细胞凋亡对早期激素性股骨头坏死进程的抑制或扭转意义重大。Ghrelin是在老鼠胃中被提取出来的一种含28个氨基酸的多肽分子,许多的生理功能主要由生长激素促泌素受体1a（GHSR 1a）介导从而发挥生物学作用。除了在胃中表达以外,Ghrelin还可以在十二指肠,空肠,回肠,结肠,肺,心脏,胰腺,肾脏,睾丸,垂体和下丘脑等许多组织中表达。近年来越来越多的证据表明,Ghrelin除了对机体能量代谢调节有重要作用外,对骨、软骨代谢以及免疫、炎症调节的作用正逐渐被人们认识,在骨和软骨的代谢中起着重要的作用。但目前关于Ghrelin在激素性股骨头坏死中的作用研究还比较少,对激素性股骨头坏死有怎样的影响及其可能机制还不甚详尽。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）是一个以二硫键或非共价键联接的同源二聚体糖蛋白,其促进血管形成作用最为强大,是机体最主要的血管生成因子,它通过旁分泌方式刺激内皮细胞,成骨细胞和造血细胞之间的串联来调节成骨细胞活性,并通过自分泌机制直接影响成骨细胞的功能。骨形态发生蛋白(（Bone Morphogenetic Proteins,BMP）是促进骨再生的信号分子,BMP2对成骨诱导活性的强度最高,可高度促进骨形成及表达,并能促使特异性骨细胞产物的分泌、生成,通过Smads或MAPK两条途径促进转录因子Runx2及Osx而促进成骨细胞特异性的基因表达。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow-mesenchymal Stromal Cells,BMSCs）是骨髓中除造血干细胞外存在的另一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,其主要分化方向为成骨分化和成脂肪分化,其不仅可分化为脂肪细胞、肌细胞及成纤维细胞,还可分化为骨细胞及软骨细胞等。目前多项研究结果提示过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferators Activated Receptors,PPAR）家族中的亚型PPARγ2作为一种核受体,可调节BMSCs由骨细胞向脂肪细胞转化,从而抑制骨形成,增强骨髓脂肪生成。Runx即相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）在骨代谢调节方面作用最为显著,Runx2在成骨细胞分化过程中发挥关键作用可能与BMP2/Smads/Runx2/Osterix信号通路密切相关。综上,Ghrelin是否可以影响激素性股骨头坏死进进程?是否可以通过调节VEGF、BMP2的表达改善激素性股骨头坏死?它能否在BMSCs成骨或成脂肪分化过程中能够起到重要调节作用?依据上述研究背景本实验首先进行了体内实验,通过建造兔激素性股骨头坏死模型,Ghrelin干预后观察股骨头组织病理学变化、血清脂质变化、股骨头组织中VEGF和BMP2的表达情况,推断Ghrelin对激素性股骨头坏死的影响及可能机制;体外实验观察Ghrelin对BMSCs细胞中BMP2、Runx2、PPARγ2蛋白和mRNA表达的影响,对细胞上清液中VEGF表达的影响综合证明Ghrelin对BMSCs不同分化方向的影响及可能机制,进一步证明Ghrelin对激素性股骨头坏死的影响及可能机制。研究内容1.体内实验部分:Ghrelin对兔激素性股骨头坏死的影响及可能机制研究。2.体外实验部分:Ghrelin对BMSCs不同分化方向的影响及可能机制研究。研究方法1.Ghrelin对兔激素性股骨头坏死的影响及可能机制研究。体内实验采用甲强龙联合马血清建造兔激素性股骨头坏死的模型,将成功造模的新西兰兔分为对照组和干预组,通过给予Ghrelin干预,采集血清及股骨头组织,通过检测各组血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平、影像学变化、股骨头组织病理学变化及VEGF和BMP2的表达情况,探讨Ghrelin对兔激素性股骨头坏死的影响及可能机制。2.Ghrelin对BMSCs不同分化方向的影响及可能机制研究。体外实验通过培养骨髓间充质干细胞,适宜浓度的Ghrelin作用于细胞培养基中,孵育过夜后RT-PCR检测细胞中BMP2、Runx2和PPARγ2 mRNA的表达;Western Blot检测细胞中BMP2、Runx2和PPARγ2的表达;Elisa检测细胞上清液中VEGF的表达,与对照组对比以期探讨Ghrelin对骨髓间充质干细胞不同分化方向的影响及其可能机制。研究结果1.Ghrelin对兔激素性股骨头坏死的影响及可能机制研究。（1）一般情况及体重变化:正常组的新西兰兔毛发有光泽,活动比较灵敏,食欲好。造模组形态逐渐消瘦,毛发干枯无光泽,皮下脂肪变薄,兔行动时弹跳距离近,后下肢笨拙,高度减少。正常组体重一直在增长,造模组在注射马血清之后体重有所下降,Ghrelin干预组体重增长速度明显快于对照组。（2）磁共振检查用来明确激素联合马血清造模是否成功。正常组股骨头可见片状T1,T2信号正常,髋关节腔内未见液体信号;对照组可见片状长T1,长T2异常信号,且髋关节腔内可见液体信号较正常组强;Ghrelin干预组可见片状长T1,略长T2异常信号可,关节腔积液信号略高。（3）组织病理学检查正常组可见软骨细胞及层次正常,空骨陷凹少见。髓腔内可见大量造血细胞,脂肪比例正常。对照组可见骨小梁广泛稀疏、断裂,软骨区内可见成片状空骨陷凹;造血细胞广泛破损。Ghrelin干预组可见软骨细胞肥大,核位于中央,脂肪细胞较多,骨小梁稀疏,偶见断裂,脂肪细胞轻度肥大,在骨髓中所占比例多于正常,无融合现象。造模组可见软骨细胞排列散乱,胞核浓缩,偏于一侧,空骨陷凹数增多。骨小梁稀疏、变细,脂肪细胞增多增大,部分融合成泡。（4）血清脂质检测Ghrelin干预组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的水平明显低于对照组,高密度脂蛋白高于对照组,Ghrelin干预组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白水平与正常组比较差异不大。（5）股骨头组织中 VEGF mRNA、BMP2 mRNA 的表达。Ghrelin 组 VEGF mRNA、BMP2mRNA的表达明显高于对照组和空白组,对照组VEGF mRNA、BMP2 mRNA的表达高于空白组。2.Ghrelin对BMSCs不同分化方向的影响及可能机制研究（1）Western blot检测Ghrelin干预组和对照组细胞中BMP2、Runx2和PPARγ2蛋白的表达发现,Ghrelin干预组BMP2表达明显高于对照组,Ghrelin干预组Runx2的表达明显高于对照组;对照组PPARγ2的表达高于Ghrelin干预组。（2）RT-PCR检测Ghrelin干预组和对照组细胞中BMP2mRNA、Runx2mRNA和PPARγ2 mRNA的表达发现,Ghrelin干预组BMP2 mRNA表达明显高于对照组;Ghrelin干预组Runx2 mRNA的表达明显高于对照组;对照组PPARγ2mRNA的表达高于Ghrelin干预组。（3）Elisa检测细胞上清液中VEGF的表达,发现Ghrelin干预组VEGF表达明显高于对照组。结论1.Ghrelin可以改善早期兔激素性股骨头坏死的脂质代谢、病理学表现,延缓早期兔激素性股骨头坏死的进程。2.Ghrelin可以通过促进VEGF mRNA、BMP2 mRNA的表达促进早期兔激素性股骨头坏死血管形成和骨形成。3.Ghrelin可以通过促进BMSCs中BMP2、Runx2、VEGF的表达,抑制PPARγ2的表达,促进成骨分化,抑制成脂肪分化。