基于碳点的新型多功能抗菌体系的构建及其活性研究

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目的:皮肤外伤后引起的细菌感染已成为世界范围内严重的公共卫生健康问题,临床对细菌感染的伤口有多种处理方式,如清创、使用消毒水冲洗、服用抗生素等,但仍有处理不当,使致病菌进入血液循环,在血液中生长繁殖,产生毒素引发全身败血症的案例。此外,用于治疗细菌感染的抗生素易产生耐药性,使治疗效果降低。目前已报道了多种新型的有机小分子等抗菌材料来应对这一危机,然而存在合成复杂、原材料价格昂贵等缺陷。因此急需开发制备简单廉价且高效杀菌的新材料。碳点(Carbon dots,CDs)因其良好的光学性能、分散性、稳定性、生物相容性、低的合成成本及简便的合成方法而受到科研工作者的广泛关注,在金属离子传感、生物成像、催化和药物递送等领域都显示出广阔的应用前景。目前碳点的抗菌治疗方式单一,因此本文基于新型碳点构建了有效杀菌的多功能纳米平台,并研究其在细菌感染伤口的治疗效果,具体内容如下:1.以柠檬酸和1-(2-甲基-5-硝基苯基)胍硝酸盐为原料,超纯水为溶剂,通过水热法合成了具有抗菌活性的蓝色荧光碳点(PDCDs)。在PDCDs上进一步螯合具有杀菌作用的Cu2+,研究PDCDs和PDCDs@Cu在体外对铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌的杀伤性能,试图开发一种生物安全性高,可杀菌的纳米药物。2.以柠檬酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)为原料,甲酰胺为溶剂,通过水热法合成了发射红色荧光、具有光热性能的(PTCDs)。在PTCDs上螯合具有抗菌活性的Ag+,进一步与热激发产生自由基的偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐(AIPH)混合到明胶制备的水凝胶中得到一种新型的多功能水凝胶,用于多手段协同杀菌。方法:1.以柠檬酸和1-(2-甲基-5-硝基苯基)胍硝酸盐为原料,一步水热法合成了PDCDs,并对其合成时间、原料质量比和合成温度进行了优化。通过TEM、AFM、XRD、XPS和FTIR等对其形貌以及组成元素进行表征;测试PDCDs的荧光光谱、紫外-可见光吸收光谱和光动力性质对其性能进行研究;用MTT法测试了其细胞毒性。鉴于PDCDs对Cu2+具有良好的螯合能力,最后制备金属螯合碳点(PDCDs@Cu),并研究其对铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌的杀伤作用。2.以柠檬酸和EDC为原料,甲酰胺为溶剂,一步溶剂热法合成PTCDs,优化合成条件后制备性能优异的PTCDs。对其形貌粒径以及组成元素进行了表征;用紫外-可见光分光光度计,荧光分光光度计等测试了PTCDs的光学性能;使用MTT法测试其细胞毒性。鉴于PTCDs优异性能制备得到金属螯合的碳点(PTCDs@Ag),最后将其与AIPH共同负载于明胶制备的水凝胶中,采用模板细菌金黄色葡萄球菌研究其杀菌性能及探究生物膜形成后的杀菌性能,最终应用于活体进一步验证其对感染伤口的治疗效果。结果:1.TEM和AFM表征结果显示PDCDs粒径均一且尺寸主要集中在2-3 nm,XRD谱图显示其为无定形碳结构,XPS和FTIR谱图显示其表面主要含有羟基,羧基以及氨基等亲水性基团;荧光光谱测试结果显示PDCDs荧光发射峰位于440 nm(360 nm激发)且荧光不受离子强度、广泛p H及储存时间的影响,具有良好的光学稳定性,Cu2+对其有明显的荧光淬灭现象,说明PDCDs可以螯合Cu2+;通过ROS探针检PDCDs@Cu在氙灯的照射下产生ROS的能力,结果显示PDCDs具有良好的光动力性能;MTT结果显示其拥有低的细胞毒性,此外,利用涂布平板实验研究了PDCDs@Cu对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀伤性能,结果显示相同条件下,PDCDs@Cu可选择性的杀伤铜绿假单胞菌。2.对合成条件优化可知,PTCDs的最佳合成条件为反应时间2 h,反应物质量比例5:1(柠檬酸:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、反应温度200℃。合成的PTCDs粒径小,由无定形碳组成,表面含亲水性基团,因此有良好的水溶性。PTCDs发红色荧光,最佳激发550 nm,最佳发射650 nm,光学稳定性好;Ag+对其有荧光淬灭现象,说明PTCDs可以螯合Ag+。在660 nm的激光照射下有良好的光热效应且光热性能稳定。将其与Ag+螯合且和AIPH共同负载于明胶中制备温敏响应水凝胶PTCDs@Ag-AIPH Hydrogel。该水凝胶为多孔结构,有良好的吸水性能,有利于吸收伤口部位的渗出液,在体外可杀伤金黄色葡萄球菌及其生物膜而无明显的细胞毒性。在活体实验中,复合水凝胶也表现出了良好的杀菌性能且没有对小鼠的肝肾功能造成损害。结论:本论文合成两种性能优良的碳点,并将碳点与其他抗菌物质结合探究其协同杀菌性能。首先,以柠檬酸和1-(2-甲基-5-硝基苯基)胍硝酸盐为原料,超纯水为溶剂,通过水热法合成了氙灯照射下可产生ROS的PDCDs,在此基础上连接具有杀菌性能的Cu2+得到复合材料PDCDs@Cu,在体外对铜绿假单胞菌有良好的杀菌性能。其次,以柠檬酸和EDC为原料,甲酰胺为溶剂,通过溶剂热法合成了具有红色荧光,光热性能良好的PTCDs,将其与Ag+螯合,并与AIPH共同负载于明胶制备的水凝胶中,制成了吸水性能好,毒性低的复合水凝胶。其在环境温度大于37℃时由固态转为液态。我们通过660 nm激光照射使PTCDs产热溶解水凝胶,并激活AIPH生成烷基自由基,通过热,烷基自由基和Ag+协同杀菌,在体内外对金黄色葡萄球菌及其生物膜有优异杀伤性能。总之,我们合成了两种性能优异的碳点并将其与其它材料结合取得了良好的协同杀菌效果。
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