多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种常见的血液系统恶性肿瘤,其发病与浆细胞的异常过度增生有关,主要表现为单克隆免疫球蛋白异常的过度表达。近年来发病率呈现逐步上升趋势,传统化疗的中位生存期不超过3年。尽管新的抗MM药物的应用及自体造血干细胞移植提高了治疗缓解率及生存时间,但几乎所有MM患者因残留细胞的持续存在导致肿瘤复发。研究已表明MM的发生发展与癌基因过度表达以及抑制基因失活密切相关,但目前对其发生发展的精确分子机制尚不清楚。因此,深入研究多发性骨髓瘤发生、发展及精确分子机制,是临床亟待解决的问题。转化生长因子β诱导基因(transforming growth fa tor-beta induced gene,TGFBI)是一个细胞外基质分子,参与细胞间通讯和信号传递,具有调节细胞恶性增殖和侵袭能力。TGFBI在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胚胎性横纹肌肉瘤等多种恶性肿瘤中存在表达下调或缺失。研究显示TGFBI具有抗肿瘤功能,可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移能力,提高化疗药物敏感性和疗效,延长患者的生存期。TGFBI作为一个抑癌基因,参与肿瘤发生、发展,是肿瘤基因诊断和治疗的理想靶点。目前TGFBI在多发性骨髓瘤中表达水平及与其发生、发展和作用机制尚不清楚。本研究选取TGFBI为靶点,探讨其在多发性骨髓瘤患者骨髓标本中的表达,并分析其表达水平与临床病理之间关系。通过构建TGFBI慢病毒过表达载体,上调多发性骨髓瘤细胞中的TGFBI表达水平,在体内外观察多发性骨髓瘤细胞增殖能力、细胞凋亡及侵袭转移等恶性表型的变化,并探讨其可能作用机制。本研究旨在明确TGFBI在多发性骨髓瘤中潜在治疗价值,以期为多发性骨髓瘤患者靶向治疗提供新靶点。实验方法与结果:第一部分:TGFBI在多发性骨髓瘤中的表达及其临床意义实验方法:选取确诊多发性骨髓瘤患者94例,收集患者临床病历资料。采用免疫组织化学染色检测多发性骨髓活检组织中TGFBI蛋白表达,分析其表达水平与多发性骨髓瘤患者临床病理之间的关系。实验结果:TGFBI在多发性骨髓瘤中低表达或缺失,其表达水平与患者发病年龄、临床分期和治疗疗效呈负相关,与患者性别无关。第二部分:TGFBI过表达慢病毒载体构建及鉴定实验方法:采用PCR法获取TGFBI基因CDS全长序列,并通过琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。采用Age I限制性内切酶,酶切GV208质粒载体线性化,通过T4DNA连接酶将目的基因TGFBI连接至载体GV208中,构建GV208–TGFBI重组质粒载体,然后转化入感受态DH5α细菌,经转化、抽提重组质粒载体。采用特异性引物,经PCR扩增含有GV208和目的基因TGFBI片段,挑取阳性克隆行DNA测序鉴定。将构建成功的GV208-TGFBI慢病毒质粒载体,转染入293T细胞中,经过病毒包装、收获及浓缩,测定慢病毒液的滴度。将获取的慢病毒液感染多发性骨髓瘤RPMI8226细胞,荧光显微镜下及流式细胞仪检测细胞感染效率。RT-PCR及western-Blot法检测感染前后多发性骨髓瘤RPMI8226细胞中的TGFBI m RNA和蛋白表达。实验结果:采用PCR法获取目的基因TGFBI CDS全长序列。通过连接反应,成功将其连接至GV208慢病毒质粒载体中,经PCR扩增,电泳和DNA测序鉴定,成功构建GV208-TGFBI过表达慢病毒载体。转染239T细胞后,通过病毒包装、浓缩,测定慢病毒液的滴度为2.0×108TU/ml。将GV208-TGFBI慢病毒质粒载体感染多发性骨髓瘤RPMI8226细胞,流式细胞检测转染率均在90%以上。采用RT-PCR及Western-blot法检测感染前后TGFBI m RNA和蛋白表达发现:感染慢病毒GV208-TGFBI组第48h,多发性骨髓瘤RPMI8226细胞中TGFBI m RNA的表达明显升高,其表达量较感染空载慢病毒GV208组提高了4.8和4.6倍,与未感染组及感染空载慢病毒GV208组比较,差异具有统计学意义(P﹤0.01)。第三部分:TGFBI基因调控多发性骨髓瘤细胞恶性表型及其作用机制的体外实验研究实验方法:实验分为两组:GV208组为对照组,GV208-TGFBI组为实验组。将上述成功构建的慢病毒重组质粒感染多发性骨髓瘤RPMI8226细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,Transwell检测细胞侵袭能力,Western blot法检测多发性骨髓瘤细胞中Cyclin D1、MMP2、VEGF蛋白表达。实验结果:CCK-8及流式细胞检测结果显示:GV208-TGFBI组中多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖能力明显低于GV208组,随着时间延长,差异更明显;G0/G1期细胞比例增多,而S期细胞明显减少,细胞凋亡明显增加,达到35.02%,与GV208组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。细胞侵袭能力结果显示:GV208-TGFBI组中的多发性骨髓瘤RPMI8226细胞穿过微孔膜的细胞数量为98±7个/视野,而GV208组的穿膜细胞数为255±12个/视野,差异也具有统计学意义(P<0.05)。同时GV208-TGFBI组多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的Cyclin D1、MMP2、VEGF蛋白表达均明显下调,与GV208组相比,其蛋白表达水平分别抑制了59.0%,67.4%及80.0%,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。第四部分:TGFBI基因调控多发性骨髓瘤裸鼠移植瘤恶性表型及其作用机制的体内实验研究实验方法:将感染GV208和GV208-TGFBI多发性骨髓瘤RPMI8226细胞接种于动物皮下,构建裸鼠移植瘤模型。观察肿瘤细胞生长、测量肿瘤的长径和短径,计算肿瘤体积和肿瘤抑瘤率。透射电镜观察肿瘤组织细胞超微结构,Western blot法检测肿瘤组织中TGFBI、PCNA、Cyclin D1、MMP2、VEGF蛋白表达。实验结果:成功构建多发性骨髓瘤RPMI8226细胞裸鼠移植瘤模型。GV208组及GV208-TGFBI组细胞成瘤时间分别为6天和10天。GV208-TGFBI组多发性骨髓瘤裸鼠移植瘤生长速度缓慢,随着时间延长,肿瘤体积较小,重量较轻,其抑瘤率达到了62.03%。透射电镜结果显示:GV208-TGFBI组多发性骨髓瘤细胞中,细胞坏死和细胞凋亡等形态改变增加,肿瘤细胞增殖能力下降。GV208-TGFBI组的多发性骨髓瘤组织中TGFBI蛋白表达显著升高,其蛋白表达提高了3.74倍,而PCNA、Cyclin D1、MMP2、VEGF蛋白表达明显降低,蛋白表达分别抑制了52.1%、55.1%、71.4%及77.8%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。