藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和某些隐藻中的捕光色素蛋白,是多亚基组成的蛋白复合物。藻胆蛋白共价结合一个或多个藻胆色素,具有很强的荧光,可以作为荧光探针用于免疫荧光检测。由于免疫荧光技术相较于放射免疫、酶联免疫等其他免疫标记技术灵敏度高且安全无毒,从而在环境监测、食品检验、医学检验等领域得到广泛的应用,而藻胆蛋白荧光探针以其荧光强度高、性质稳定、安全可靠的优势,也成为研究的热点。本研究所涉及的别藻蓝蛋白是藻胆蛋白的一种,别藻蓝蛋白单体同样具有优良的光学特性,且分子量小,易与其它生物大分子交联,符合新一代荧光标记物的要求。藻胆蛋白的来源主要有两种,天然提取和异源表达,天然提取纯化工艺复杂,而基因工程原理的优势在于得到的蛋白结构单一、易纯化,方便进行人工改造,而且具有天然藻胆蛋白相似的光谱学特征。本研究利用代谢工程原理,将含链霉亲和素与脱辅基别藻蓝蛋白α亚基融合基因(SLA)以及裂合酶基因(cpcS)的表达载体分别与藻红胆素合成酶基因(Ho1、PebS)表达载体或藻蓝胆素合成酶基因(Ho1、PcyA)表达载体共转化大肠杆菌,经过诱导分别得到结合藻红胆素或藻蓝胆素的链霉亲和素与别藻蓝蛋白α亚基融合蛋白(SLA-PEB或SLA-PCB)。对重组蛋白SLA-PEB和SLA-PCB进行了表达和分离纯化,并对其生物学活性进行了分析,二者分子量均为34.5 kDa,纯度可达95%以上,最大吸收峰分别为550 nm、614 nm,荧光发射峰分别为562 nm、633 nm,摩尔消光系数分别为402400 M-1·cm-1、422400 M-1·cm-1,荧光量子效率分别为0.91、0.33,光漂白速率分别为1.5×10-3 min-1、1.7×10-3 min-1,生物素结合活性分别为16.4 U、6.9 U,色基结合率分别为34.2%、21.1%。另外对重组蛋白的稳定性进行了研究,发现EDTA、NaN3等抑制剂有助于提高重组蛋白的稳定性,保存于4℃80天后,SLA-PEB和SLA-PCB荧光值下降均不足10%,保存于37℃7天后,SLA-PEB荧光值下降20.8%左右,SLA-PCB荧光值下降26.4%左右。由于在大肠杆菌体内生物合成的重组别藻蓝蛋白色基结合率较低,本研究设计了体外催化实验,将藻红胆素(PEB)、藻蓝胆素(PCB)和裂合酶(CpcS)分别单独表达并纯化,再将色基结合率较低的重组别藻蓝蛋白纯化样品与裂合酶和色基在体外条件下进行催化重组,并再次进行纯化,分析纯化前后蛋白的光谱。结果发现SLA-PEB色基结合率没有明显提高,SLA-PCB的色基结合率由21.1%提高至86.5%。以重组别藻蓝蛋白SLA-PEB和SLA-PCB为荧光探针,并以商品化链霉亲和素标记的藻红蛋白(SA-PE)为对照,建立AFP、CEA、NSE固相免疫荧光检测方法,并对检测方法的各项性能指标进行了规范的评价。AFP、CEA、NSE的线性范围分别为0.02-50 ng/m L、0.05-200 ng/mL、0.1-1000 ng/mL,且分别以SAPE、SLA-PEB和SLA-PCB为探针,检测范围结果一致;除NSE的检测限较高,AFP、CEA的检测限均小于1 ng/m L,说明该方法的灵敏度较高;AFP、CEA、NSE的批内不精密度均小于10%,批间不精密度均小于15%,说明该方法的重复性较好;将反应体系组份于37℃放置3天、6天后,检测荧光值有所下降,但是检测范围不变且标准曲线线性良好,检测限升高不超过10%,批内不精密度仍小于10%,批间不精密度仍小于15%,说明该方法稳定性较好;除AFP、CEA低浓度样品相对偏差较大,其它相对偏差均不超过10%,说明该方法的准确度较高;抗体与无关抗原反应无信号,与相关抗原反应信号明显,说明该方法的特异性较好。本研究实现了重组别藻蓝蛋白荧光探针在大肠杆菌体内的组合生物合成,通过有效的提取纯化方法得到了高纯度蛋白,并通过体外催化的方式改善了荧光探针的荧光性质,为重组藻胆蛋白荧光探针的制备奠定了基础。另外,建立了AFP、CEA、NSE固相免疫荧光检测方法,为其临床应用奠定了基础。