论文部分内容阅读
乳酸菌胞外多糖(lactic acid bacteria exopolysaccharides，LAB EPS)具有抗肿瘤、免疫调节、降胆固醇及调节胃肠道功能等诸多生物学特性，并被广泛应用于食品加工领域之中。而肠道则是任何食品的必经之地，做为一种食源性生物活性物质，乳酸菌胞外多糖对肠道的免疫调节潜能就显得尤为重要。但目前关于乳酸菌胞外多糖对肠黏膜免疫系统的调节的研究尚未展开，关于干酪乳杆菌胞外多糖对肠相关淋巴组织中T淋巴细胞及其重要亚群γδT淋巴细胞的影响尚未见报道。因此，本课题系统研究干酪乳杆菌胞外多糖对四种主要肠相关淋巴组织中T淋巴细胞的影响，并重点分析对γδT淋巴细胞的免疫调控，旨在探讨乳酸菌胞外多糖对肠道免疫系统的影响，丰富乳酸菌胞外多糖提高肠道免疫力的作用机制。
本课题主要包括以下几个方面：(1)从干酪乳杆菌的发酵液中提取EPS。(2)利用Percoll不连续密度梯度分离法及机械破碎法分离四种小鼠小肠相关淋巴组织中淋巴细胞：上皮内淋巴细胞(IEL)、固有层淋巴细胞(LPL)、派氏集合淋巴结淋巴细胞(PPL)及肠系膜淋巴细胞(MLNL)。(3)采用WST-1法检测EPS对体外刀豆素A(ConA)诱导的T及γδT淋巴细胞增殖的影响(4)利用ELISA法检测EPS对体外ConA诱导的T及γδT淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-17及TNF-α的影响。(5)对小鼠进行灌胃EPS处理，流式细胞仪分析灌胃EPS对四种肠相关淋巴细胞中对γδT淋巴细胞的影响；并以抑制γδT淋巴细胞型小鼠为阴性对照，利用RT-PCR检测小鼠肠道IFN-γ、IL-17及TNF-α转录水平，采用ELISA法检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-17及TNF-α的含量，对比分析EPS对小鼠γδT淋巴细胞的免疫调控。
本研究主要得到以下结果：
(1)经过解剖学、组织学及细胞形态的观察，确定成功分离提起小鼠小肠四种肠相关淋巴组织中淋巴细胞。
(2)干酪乳杆菌EPS能够促进体外ConA诱导的肠IEL中T淋巴细胞及MLNL中T淋巴细胞的增殖，且差异显著或极显著(P<0.05 P<0.01)，并在一定范围内呈剂量依赖性。
(3)干酪乳杆菌EPS能够不同程度促进体外ConA诱导IEL、LPL、PPL及MLNL中T淋巴细胞分泌IL-17，且与对照组相比存在显著或极显著差异(P<0.05 P<0.01)；200μg/mLEPS能够促进MLNL中T淋巴细胞分泌TNF-α，且差异极显著(P<0.01)，抑制IEL中T淋巴细胞分泌TNF-α，且差异极显著(P<0.01)；与抑制γδT细胞实验组对比分析表明，IEL中γδ T淋巴细胞是分泌IL-17及TNF-α的主要细胞，并且EPS能够抑制体外ConA诱导的IEL中γδT淋巴细胞分泌TNF-α，且差异极显著(P<0.01)，促进IEL中γδT淋巴细胞分泌IL-17，且差异极显著(P<0.01)。
(4)灌胃EPS能够提高小鼠IEL、LPL、PPL中的CD3+γδT淋巴细胞百分含量，分别由15.4％、6.8%、0.3%提升至17.6%、10.9%、0.9%；灌胃EPS能够提高小鼠IEL、LPL中的CD8+γδT淋巴细胞百分含量，分别由15.4%、3.7%提升至23.4%、14.2%；与抑制γδT细胞实验组对比分析表明，γδT淋巴细胞参与肠道IL-17及TNF-α mRNA的表达，并且EPS能够作用于肠道γδT淋巴细胞进而上调IL-17 mRNA的表达；与抑制γδT细胞实验组对比分析表明，γδT淋巴细胞参与外周血中IL-17及IFN-γ的分泌，并且EPS能够促进γδT淋巴细胞分泌IL-17及IFN-γ(P<0.05)。
综上所述本课题可以得出以下结论：干酪乳杆菌EPS能够一定程度的影响体外ConA诱导的小鼠小肠相关淋巴组织中的T淋巴细胞的增殖及TNF-α、IL-17细胞因子的分泌。尤其可以从体内外两种途径，不同程度的影响小鼠小肠相关淋巴组织中重要T淋巴细胞亚群-γδT淋巴细胞的数量及主要细胞因子的变化。实验结果为阐明干酪乳杆菌胞外多糖对肠道免疫系统的调节做出初步的探讨，也初步确定了干酪乳杆菌胞外多糖具有调控肠相关γδT淋巴细胞的免疫功能。