MLCK的PKA磷酸化位点在IL-8诱导的VSMCs增殖和迁移中的作用

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:hanzedong
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背景:根据世界卫生组织2015年的实况报道,每年死于心血管疾病的人数多于其他任何死因。我国是心血管疾病高发国家,心血管疾病占我国每年总死亡病因的51%,因此,对心血管疾病的研究刻不容缓。心血管疾病通常都与动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发生密切相关,而动脉粥样硬化的发生、发展与一些炎性因子的介入密不可分。白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8),是一种趋化性细胞因子,能够促进炎症细胞趋化,此外IL-8有促进有丝分裂的作用,能够直接引起细胞增殖。研究发现IL-8能够促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖和迁移,在AS的形成过程中发挥着重要作用。鉴于IL-8介导平滑肌细胞增殖和迁移的分子机制尚未完全阐明,因此有必要对此进行深入的研究。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)是一种与细胞收缩相关的关键酶。作为一种多功能域蛋白质,MLCK能够激活其下游的肌球蛋白轻链(Myosin light Chain,MLC),引起细胞收缩。同时MLCK也可被多种其他激酶如蛋白激酶 A(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)、Rho 等磷酸化,从而调节其活性最终影响细胞功能。上述MLCK分子的激酶结合位点对MLCK功能的发挥具有不同的调节作用。近年来不断有研究报道MLCK与动脉粥样硬化的形成具有密切联系,但MLCK分子哪些激酶结合位点在平滑肌细胞增殖和迁移过程中发挥作用还未见报道。目的:通过在豚鼠脑基底动脉平滑肌细胞(GbaSM-4)中过表达MLCK,探索MLCK在平滑肌细胞增殖和迁移中的作用,并构建MLCK的PKA位点模拟磷酸化和去磷酸化突变的真核表达载体,通过基因转导技术探索MLCK的PKA磷酸化位点在IL-8诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及相关信号通路调控机制。方法:(1)细胞系:本实验所用细胞为豚鼠脑基底动脉平滑肌细胞GbaSM-4及MLCK表达敲低的MLCK-/Gba细胞;(2)表达载体:本实验所用到的表达载体包括 MLCK 真核表达载体 pCDNA3.1+-Flag-MLCK(简称 pCDNA3.1+-MLCK)、MLCK的PKA位点模拟磷酸化突变体pCDNA3.1+-Flag-MLCK-S993D(简称MLCK-S993D),MLCK的PKA位点模拟去磷酸化突变体pCDNA3.1+-Flag-MLCK-S993A(简称 MLCK-S993A);(3)通过基因转导技术将pCDNA3.1+-MLCK转入GbaSM-4细胞中,使其过表达MLCK,研究MLCK对GbaSM-4细胞增殖、迁移能力的影响;同样的方法将MLCK-S993D、MLCK-S993A转入MLCK-/Gba细胞中,使其分别表达PKA位点模拟磷酸化和去磷酸化突变的MLCK分子,研究PKA位点不同磷酸化状态对MLCK分子功能的影响;(4)用CCK-8的方法检测细胞增殖情况;(5)用BoydenChamber法检测细胞的迁移情况;(6)利用RT-PCR方法检测与细胞增殖、迁移相关的细胞因子表达情况,如:PCNA、CyclinD1、α-SMA;(7)用Western blot方法检测MLCK、α-SMA、p-ERK等蛋白的表达情况;(8)用明胶酶谱方法检测细胞培养液中MMP2的活性;(9)实验数据采用SPSS16.0统计软件进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)20ng/mLIL-8刺激GbaSM-4细胞24h后,能够促进细胞的增殖和迁移能力,过表达MLCK分子也能够增强GbaSM-4细胞增殖、迁移能力;(2)采用定点突变的方法,成功构建了 MLCK分子PKA位点去磷酸化突变的真核表达载体MLCK-S993A,pCDNA3.1+-MLCK、MLCK-S993D 由实验室前期构建;(3)在20ng/mL IL-8诱导作用下,MLCK的PKA位点磷酸化与去磷酸化突变均不影响GbaSM-4细胞增殖作用;(4)在20ng/mL IL-8诱导作用下,MLCK分子的PKA位点模拟磷酸化能够促进GbaSM-4细胞迁移作用,模拟去磷酸化能抑制GbaSM-4细胞迁移作用;(5)当MLCK分子的PKA位点去磷酸化突变后,GbaSM-4细胞的p-ERK表达量降低。结论:1.IL-8能够促进GbaSM-4细胞的增殖和迁移作用,这种促进作用可能与上调MLCK的表达量相关。2.MLCK的PKA磷酸化位点与IL-8诱导的GbaSM-4细胞增殖关系不明显。3.MLCK的PKA磷酸化位点与IL-8诱导的GbaSM-4细胞迁移作用相关,PKA位点磷酸化能够促进细胞迁移;PKA位点去磷酸化能够抑制细胞迁移,且这种抑制作用与MAPK/ERK信号通路活化相关。
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