由于创伤、骨病或骨肿瘤引起的骨缺损是影响人类生命和健康的重大医学难题。虽然传统的骨缺损修复材料可以部分满足替代缺损部位的需求,但难以满足血管长入及功能化等需求,仍然无法实现骨组织在结构和功能上的完全修复,即再生重建。引导干细胞长入支架内部并诱导其成骨分化生成新骨是实现真正意义上“再生”的重要标志。因此,研制可调控干细胞行为和骨组织再生过程的生物活性材料是再生修复的重点。微小RNA(miRNA)在调控干细胞分化、骨形成及其内稳态等生命活动中发挥着重要的作用。且相比于生长因子,miRNA结构简单、易于合成及操作、不易失活、且能特异性地从基因水平调控细胞的行为,使其成为近十年来医药领域最热门的研究方向之一。本文的核心思想是将miRNA作为一种生物学信号负载于三维多孔支架材料上,构建具有骨诱导活性的组织工程支架作为植入修复材料,联合干细胞用于骨组织工程,并通过原位控释miRNA,刺激干细胞产生特殊应答反应,以期得到最佳的修复效果。(1)miRNA纳米输送载体的构建miRNA能否高效发挥效用极大程度依赖于纳米输送载体的选择和设计。因此,本文首先利用一种高效输送小分子核酸的载体材料——聚乙烯亚胺修饰的金纳米颗粒(AuNPs),输送miRNA跨膜进入干细胞并发挥其调控成骨分化的作用。研究结果证明,相较于商业化脂质体Lipofectamine,AuNPs具有较低的细胞毒性,可保护并高效输送miRNA进入人骨髓间充质干细胞(hMSCs)和小鼠胚胎前成骨细胞(MC3T3-E1)。并发现AuNPs/miRNA复合粒子可协同诱导两种细胞成骨分化并促进矿化过程。进一步观察到AuNPs主要分布于内质网上,据此推测AuNPs诱导成骨分化的机制可能是纳米粒子对内质网产生适当的应力刺激,激活内质网应激效应,从而影响成骨分化相关蛋白的表达。(2)无负载AuNPs/miRNA三维凝胶支架的构建为了实现miRNA在骨再生修复方面的应用,引入三维多孔支架作为药物控释的载体和细胞组织长入的临时模板必不可少。由于明胶和海藻酸钠等天然凝胶材料具有良好的药物负载和释放能力,本研究采用明胶/海藻酸钠混合凝胶作为负载miRNA的支架材料,利用三维纤维成型技术成型,成功制备了具有三维连通规则孔结构的凝胶大孔支架,并系统研究了凝胶交联度对支架理化性能的影响。研究结果证明,凝胶的交联度对支架的结构形貌、孔隙率和孔径分布无显著影响,但可显著影响支架的吸水溶胀率、降解速率和力学性能。另一方面,通过控制纤维堆积方式得到不同孔结构的三维支架。并发现支架的孔结构对孔隙率、吸水溶胀性和降解性能无显著影响,但对孔径分布和力学性能有明显影响。以上体系的建立为构建负载AuNPs/miRNA三维支架提供了材料基础。(3)负载AuNPs/miRNA的三维凝胶支架介导干细胞成骨分化本文利用凝胶的吸水溶胀特性,成功将AuNPs/miR-29b复合粒子通过物理吸附作用负载到不同交联度的三维凝胶支架上。研究证实复合粒子可均匀分布于支架纤维的表面和内部,支架对复合粒子具有储存和缓释作用。凝胶支架表面可矿化沉积形成钙磷类纳米结构,有利于成骨分化和骨基质的形成。探讨了miRNA和凝胶交联度之间的协同作用对干细胞成骨分化的介导作用。体外实验研究发现,支架的交联度对细胞的粘附和铺展有显著影响,随着交联度提高,支架上细胞粘附数量和细胞铺展面积均增大。在成骨分化早期,低交联度支架可释放更多miRNA,对hMSCs向成骨方向分化的促进作用更为明显;进入中后期,在miRNA的缓释和支架交联度的协同作用下,高交联度的支架对hMSCs成骨分化的促进作用更为显著。进一步在体内模型中研究不同交联度的负载AuNPs/miRNA凝胶支架对干细胞成骨分化和新骨生成的介导作用。在裸鼠皮下植入两周和四周后,空白支架和负载miRNA的三维多孔支架均能介导细胞和组织快速长入,且支架交联度对细胞和组织的长入速度有明显影响。组织染色和免疫组化显示成骨和成血管的结果具正相关性,一致证明负载miRNA的高交联度支架更有利于成骨分化及血管长入。由支架交联度调控的理化性能(渗透性、降解性能、硬度等)和miRNA的释放分别为hMSCs的成骨分化提供了机械信号和生物学信号,二者协同介导hMSCs的分化行为以及新骨生成。负载miRNA的凝胶三维多孔支架是mi RNA技术和再生医学相互结合的新探索,通过领域交叉赋予了再生修复支架新的功能,并为miRNA在骨修复领域的研究应用及新一代骨修复材料的设计制备提供理论依据和新思路。