【摘 要】
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[研究目的及意义]自转运蛋白（autotransporter,AT）分泌系统是革兰氏阴性菌中病原蛋白跨外膜分泌的重要手段之一,其可通过两个连续的步骤介导蛋白质穿过阴性菌的内外膜,将蛋白质释放到胞外环境或“展示”在细菌表面,这一特性使其可用于目标蛋白在细菌表面的展示,以开发特定生物工程产品。其中,基于自转运蛋白Ag43构建的细菌表面展示系统被认为是展示外源蛋白的理想系统。然而在不同的研究中,外源蛋白
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[研究目的及意义]自转运蛋白（autotransporter,AT）分泌系统是革兰氏阴性菌中病原蛋白跨外膜分泌的重要手段之一,其可通过两个连续的步骤介导蛋白质穿过阴性菌的内外膜,将蛋白质释放到胞外环境或“展示”在细菌表面,这一特性使其可用于目标蛋白在细菌表面的展示,以开发特定生物工程产品。其中,基于自转运蛋白Ag43构建的细菌表面展示系统被认为是展示外源蛋白的理想系统。然而在不同的研究中,外源蛋白取代Ag43乘客结构域时选用的替换点不尽相同,在构建融合蛋白时,是否保留乘客结构域以及需要保留多少Ag43乘客结构域氨基酸才能实现表面展示的最优化,目前还有待研究。因此本研究通过构建含有不同乘客结构域的Ag43表面展示系统,以HPV16L1为外源蛋白,来探索其展示外源蛋白所需的最优化组合。在最优化组合的基础上,利用绿色荧光蛋白（EGFP）、绿色荧光蛋白纳米抗体（nanobody,NB）以及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase,βglC）三种不同的外源蛋白来检测该表面展示载体的功能性表达及通用性。[研究方法]（1）利用基因工程技术构建Ag43的四种表面展示载体:Ag43/138、Ag43/551、Ag43/552和Ag43/700;（2）利用基因工程技术构建外源蛋白-Ag43融合蛋白表达载体（3）IPTG诱导重组蛋白表达及SDS-PAGE分析;（4）利用胰蛋白酶消化验证外源蛋白在大肠杆菌的表面展示。（5）EGFP、NB及βglC表面展示及活性检测。[结果]（1）成功构建四种表面展示载体和四种HPV16L1-Ag43重组蛋白表达载体。经IPTG诱导后,构建的四种表面展示载体均能表达HPV16L1蛋白。胰蛋白酶消化后,重组蛋白条带均减弱,其中,Ag43/700-HPV16L1条带减弱最明显。（2）以Ag43/700为表面展示载体,成功构建EGFP-Ag43/700、NB-Ag43/700以及βglC-Ag43/700重组蛋白质粒。经IPTG诱导后,构建的3种重组蛋白均能表达。胰蛋白酶消化后,3种重组蛋白条带均减弱。研究发现:①EGFP-Ag43重组菌在荧光显微镜下可观察到荧光,但未加IPTG组未见荧光;②表面展示的NB可识别结合EGFP,在激光照射下可产生荧光,未加IPTG及胰蛋白酶消化后均未见荧光;③以pNPG为底物,βglC-Ag43表面展示酶蛋白的酶活为0.37 U/mL。[结论]本研究成功构建了基于自转运蛋白Ag43的细菌表面展示载体,HPV16L1蛋白通过构建的四种表面展示载体均可表达并展示在大肠杆菌表面,且仅保留α-螺旋和β-桶状结构域的Ag43/700的表面展示效果最优。利用Ag43/700表面展示载体,对EGFP、NB及βglC三种外源蛋白进行细菌表面展示及功能表征,验证了该载体的通用性。
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