前言 Ag85复合体属于纤维连接素结合蛋白家族,最新研究发现这些蛋白质具有分枝酰转移酶活性,参与海藻糖索状因子的发生,可能在细菌细胞壁的合成中起作用,是维持细菌细胞壁完整性的重要结构。Ag85复合体蛋白由Ag85A,Ag85B和Ag85C组成,其中Ag85A和Ag85B较Ag85C具有重要的生物学效应。Ag85A蛋白表达于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的培养滤液中,由于结核分枝杆菌生长缓慢,并且需要较复杂生长条件,从细菌菌体中提取Ag85A蛋白易发生凝集和降解,更难于纯化。因此,在很大程度上限制了此蛋白在血清学诊断、基础免疫学研究和疫苗制备等各领域中的应用。近年来的研究发现,Ag85复合体,特别是Ag85A具有刺激细胞免疫功能增强作用。因此,人们试图将其开发成疫苗类制剂,用于分枝杆菌引起的疾病及恶性肿瘤的防治。 DNA基因克隆技术的建立与应用,为Ag85A DNA疫苗及Ag85A蛋白分子的制备和应用提供了可行性。为此,我们选择在大肠杆菌内具有高表达能力的pTrcHisB质粒作为载体,将Ag85A基因与其进行重组,并选择在大肠杆菌TOP10株中进行表达,以获高效表达Ag85A的基因重组体,为在国内制备Ag85A DNA疫苗奠定了初步基础。 方法 1.Ag85A DNA分离与纯化:在含有卡那霉素的LB培养基上培养含有Ag85A-V1Jns.tPA质粒的伤寒杆菌疫苗以获得纯克隆,按照柱式质粒小量抽提试剂盒从细菌中提取Ag85A-V1Jns.tPA质粒,并应用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的质粒。然后,用限制性内切酶BgⅢ酶切质粒释放Ag85A DNA片段,0.8%凝胶电泳观察酶切结果。最后,用QIA快速凝胶提取试剂盒提取并纯化Ag85A DNA片段。 2.载体pTrcHisB酶切:用BgⅢ酶切表达载体质粒pTreHisB,加小牛肠碱性磷酸酶脱去由BgⅢ消化产生的pTrcHisB 3′和5′末端的磷酸基,以防