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根据本实验室保存的A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)、A/Swine/Guangxi/12/ 2005(H1N1)和A/Swine/Tianjin/1/2007(H1N2)毒株序列和GenBank中已公布的猪流感病毒H3N2、H1N1和H1N2亚型的H3、N2、H1、N1和M的编码基因,设计了五对引物(M、H3、N2、H1和N1)和五条TaqMan MGB探针,RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)的M、H3、N2基因和A/Swine/Guangxi/12/2005(H1N1)的H1、N1基因,扩增片段与载体pMD18-T的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α,重组质粒pMD-M、pMD-H3、pMD-N2、pMD-H1和pMD-N1经PCR鉴定后测序,DNAStar软件分析结果显示重组质粒中连入的M、H3、N2、H1、N1基因与本实验室保存的猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)和A/Swine/Guangxi/12/2005(H1N1)的核苷酸序列同源性在97.5%以上,从而从分子水平上确定重组质粒中连入基因的正确性。在M基因单项Real-time PCR检测实验中,通过对引物和探针浓度、Mgcl2浓度、dNTP浓度、循环次数、退火温度的一系列优化比较,建立了最佳的反应体系和扩增程序,标准曲线上各点均匀一致等反应条件后,建立了Real-time PCR诊断方法,同时应用于H3、N2、H1、N1基因的检测。为使建立的方法在检测病毒同时又能量化样品中病毒含量,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品制作标准曲线,结果表明该方法的灵敏度为100拷贝/反应,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒进行检测,结果无交叉反应,特异性好、重复性佳。最后,用建立的荧光定量PCR方法对19份人工攻毒样品和30份现地样品进行检测并同时进行病毒分离,结果表明,荧光定量PCR方法和病毒分离的符合率为100%。证明建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、高通量等优点,在检测猪流感病毒和作为一种先进的猪流感病毒基因组复制定量研究方法上具有应用价值。