目的:研究当归补血汤促红细胞生成的潜在药效成分,探讨当归补血汤促红细胞生成的作用通路。方法:一、DBT促红细胞生成的药效研究。1)设计两因素三水平,即不同浓度(0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.067μg/mL)和不同孵育时间(15 min、30 min、60 min)的实验,利用流式细胞仪测量网织红细胞比例来优化网织红细胞检验的方法;2)设计分组,分为对照组(生理盐水)、高剂量组(10 g/kg)、中剂量组(5 g/kg)、低剂量组(0.1 g/kg),每组5只,分别灌胃和腹腔注射,通过分析网织红细胞比例的变化来确定给药方式、给药剂量以及给药时间点;3)CD71-FITC、Ter119-PE标记骨髓单细胞悬液,流式细胞仪验证DBT对骨髓中造血细胞系的早、中、晚期的红系相关细胞的影响;4)CFU-E培养基培养BMSCs,48 h后,计数CFU-E克隆数目;5)BFU-E培养基来培养BMSCs,7 d后,计数BFU-E克隆数目,验证DBT对红细胞分化的能力。二、DBT促红细胞生成潜在药效成分研究。1)利用MTT法探讨小鼠自体血清的制备方法和血清的最大添加量;2)末次给药后,按照自体血清的制备方法制备不同时间点含药血清;3)利用3K超滤管将含药血清的分为中药代谢小分子组与中药代谢大分子组,根据细胞增殖实验观察不同时间点含药血清的中药代谢小分子及蛋白质大分子对BMSCs体外培养的影响;4)代谢组分析不同时间点含药血清的中药入血成分和内源性成分;5)利用谱效关系、相关性分析来寻找DBT促红细胞生成的潜在药效成分。三、DBT促红细胞生成作用靶蛋白研究。1)蛋白组实验从蛋白水平来分析DBT促红细胞生成时的相关靶蛋白及作用途径;2)Elisa验证相关蛋白的表达。四、脾脏髓外造血作用通路研究。1)HE染色分析DBT对小鼠的脾脏、骨髓的影响;2)CFU-E、BFU-E实验来验证DBT对小鼠脾脏中红系祖细胞向成熟红细胞分化能力的影响;3)流式细胞仪来检测DBT对小鼠脾脏中红系相关细胞的影响;4)转录组实验从基因水平分析DBT对小鼠脾脏的基因表达的影响,预测DBT通过脾脏髓外造血的机制通路;5)Q-PCR从基因水平验证DBT促进小鼠脾脏的髓外造血的机制。结果:第二章,DBT促红细胞生成的药效研究。1)终浓度0.1μg/m L的噻唑橙,在37℃下,避光孵育30 min时网织红细胞的比例较稳定;2)小鼠腹腔注射较灌胃时,对照组网织红细胞的比例比例波动小,比较稳定;3)腹腔注射DBT,10 g/kg、5 g/kg组网织红细胞比例随时间增加而增加,但10 g/kg有小鼠致死现象;4)连续给药14 d,网织红细胞的比例显著增加;5)末次给药后,解剖小鼠发现,DBT组脾脏指数(5.22±0.4)与对照组(4.12±0.17)相比显著性增加(p<0.05);6)流式检测红系相关细胞,红系相关细胞的比例显著增加,早期红系相关细胞、中期红系相关细胞的比例显著增加,说明早期、中期红系相关细胞可能为DBT的潜在作用靶点;7)培养BMSCs,CFU-E、BFU-E的细胞数目显著增加,说明DBT可能促进红系祖细胞向成熟红细胞的分化。第三章,DBT促红细胞生成潜在药效成分研究。1)不加抗凝剂并将血清灭活更适合骨髓基质细胞的体外培养;2)5%的自体血清体外培养BMSCs时为最佳生长状态;3)将血清冻干后,20%的血清冻干粉体外培养BMSCs时为最佳生长状态;4)不同时间点含药血清培养BMSCs时,30、60、90 min含药血清中药代谢小分子的药效学活性随着取血时间的延后,药效成递增趋势,其中60 min所得血清小分子的细胞活性与对照组相比显著增加;120 min所得中药代谢小分子其药效学活性出现下降的趋势,后有呈现递增趋势,其中180 min含药血清的细胞活性与120 min相比有显著性差异;5)基于UPLC-MS的代谢组学研究含药血清的所有代谢物,代谢物变化与体外细胞药效进行相关性分析,得到与药效相关性较高的7个DBT的入血成分和15个内源性成分;6)DBT入血成分与内源性代谢物相关性分析及内源性成分的代谢通路的轮廓图,说明DBT可能通过谷氨酸、TCA循环、谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、苏氨酸等的代谢来促进红系相关细胞的生成,且谷氨酸为代谢通路的节点分子。第四章,DBT促红细胞生成作用靶蛋白研究。1)中药代谢大分子促进BMSCs的增殖;2)蛋白组分析表明,给药组和对照组的血清中鉴定出总共含有698种蛋白,其中含有243种差异蛋白,上调差异蛋白有190种,下调差异蛋白有53种;3)过滤不同差异蛋白,有20种潜在的差异蛋白通过参与骨髓造血微环境的稳态来促进红细胞的生成,主要为Regulation of actin cytoskeleton、focal adhesion、Adherens junction、Cell adhesion molecules(CAM)、Hematopoietic相关的蛋白;4)Elisa检测LTF、Vinculin、CD14的蛋白表达增加。第五章,脾脏髓外造血作用通路研究。1)脾脏切片HE染色,给药组脾脏中粒细胞数目增加;2)给药组小鼠脾脏中CFU-E、BFU-E克隆数目明显增加;3)给药组小鼠脾脏的红系相关细胞数目、比例增加,说明DBT可能促进脾脏髓外造血;4)脾脏转录组实验,转录组实验结果预测了脾脏髓外造血主要与细胞因子的趋化、调节、生成以及Jak-STAT通路相关;5)Q-PCR验证CXCL2、CCR1、CXCL1、IL-1a、PTGS2、Pim1、IL-10、CXCR2、SOCS3、IL-1b基因表达显著增加。结论:DBT具有促进红细胞生成的药效。一,DBT促进红细胞生成的潜在药效成分为RHA、TPA、TO、MEOA、PA、CDVD3、DDG。由潜在的7个DBT入血成分通过促进谷氨酸的代谢并进一步影响了其它途径代谢物的变化从而促进红系相关细胞的生成;二,DBT通过促进靶蛋白LTF、Vinculin、CD14的表达进而触发Regulation of actin cytoskeleton、Focal adhesion、Adherens junction、Cell adhesion molecules(CAM)、Hematopoietic相关通路的表达来间接促进红细胞的生成;三,DBT可促进红细胞的生成的机制为通过激活细胞因子的趋化、生成以及Jak-STAT通路相关的基因的表达来触发旁路途径-脾脏髓外造血间接促进红细胞的生成。