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结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率逐年上升。CRC是由不断积累的遗传学和表观遗传学改变所引起的。在CRC进展过程中,APC、TP53和:SMAD4基因发挥了重要作用。目前,最有效的降低CRC发病率和死亡率的方法就是早期诊断,但目前的早期诊断技术尚有很多局限。基因变异和表观遗传学改变(特别是DNA甲基化)可作为CRC早期诊断及治疗的依据。DNA甲基化在CRC疾病进程中发挥重要作用。目前,仅有少数关于CRC甲基化组学研究的报道,针对中国人群的研究就更少了。另外,目前的研究显示CRC的DNA甲基化改变存在人群和种族差异。本研究采用SeqCap Epi CpGian甲基化胞嘧啶捕获测序技术(捕获550万个CpG位点)对中国人群中26例CRC、28 例结直肠腺瘤(Colorectal Adenoma,CRA)和 6 例结直肠息肉(Colorectal Polyps,CRP)活检样本进行了深度测序。研究发现CRC、CRA和CRP的甲基化谱存在显著差异。CRC与NC间差异甲基化位点有1 582个,CRA与NC间差异甲基化位点有959个,CRP与NC间差异甲基化位点有2 011个。CRA中差异甲基化位点位于CpG岛的比例显著高于CRC和CRP。与NC相比,MYBPC3在CRC中出现低甲基化。GDF1、NEFH和SNORD82在CRA中出现高甲基化。CRP中RIMS1、BPI 低甲基化,KIF7、ZNF837 高甲基化。NEFH、SNORD82、KIF7 及ZNF837可作为CRC早期诊断标记物。对差异甲基化基因进行信号通路分析发现在CRC和CRA中差异甲基化基因在cAMP信号通路富集。cAMP信号通路可能是潜在的CRC表观遗传治疗靶标。基于DNA甲基化谱对CRC和CRA进行分类发现两组样本均可分为三类。总之,我们在CRC不同阶段鉴定出一些差异甲基化基因,在CRC进展过程中甲基化谱发生了显著改变。瘤内异质性(Intratumor Heterogeneity,ITH)表现为形态结构和基因型/表观遗传状态的不均一性以及不同标记物在相同肿瘤内的不同细胞群的表达差异。ITH导致低估肿瘤突变谱,进而影响治疗准确性。同时,ITH会阻碍多种癌症的遗传谱精确分析,进而影响预后和预测性生物标记物的鉴定。然而,我国人群中遗传ITH程度仍不清楚。随后本研究采用全基因组DNA目的片段PCR扩增及DNA测序技术在26例CRC(每例样本取4-5个区域)中分别进行APC、TP53和SMAD4基因的突变检测以研究CRC关键基因ITH。APC基因突变率为8/26(30.8%),突变分布表现为区域密集,无典型的突变热点,在两例患者中可观察到APC基因突变异质性;TP53基因突变率为11/26(42.3%),在7例患者中可观察到TP53基因突变异质性;SMAD4基因突变率为15/26(57.7%),在10例患者中可检测到该基因突变异质性。CRC关键基因在不同程度上均存在ITH。Lynch 综合征(Lynch Syndrome,LS)是由 DNA 错配修复(Mismatch Repair,MMR)基因种系突变引起的家族性疾病。LS患者发展为CRC的风险很高,因此鉴定MMR突变携带者对他们进行定期检测有重要意义。LS患者通常表现为微卫星不稳定(Microsatellite Instability,MSI)。为了在CRC患者群体中检测MSI状态以初步筛查LS患者,本研究使用5个微卫星标记物BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-24和MONO-27进行MSI检测。对MSI阳性病例进行BRAF突变检测以排除散发型CRC,并使用免疫组化评估4个DNAMMR蛋白的表达缺失情况。在60/253例(23.7%)中可检测到MSI,其中仅有1例显示BRAF突变。患者群体中1/4为LS可疑患者。建议接受遗传咨询和LS种系突变检测。为了评估CRC中MSI表型的ITH程度,本研究采用Bethesda系统对来自37例CRC的190个活检样本进行MSI分析。结果显示MSI CRC患者中,24.3%患者存在MSI表型ITH。在MSI标记方面,ITH在大多数情况下来源于单核苷酸标记(68%),但它也来自二核苷酸标记(32%)。CRC中Bethesda系统MSI表型ITH大量存在,因此需要进行多区域活检分析MSI状态以更好地评估CRC患者MSI状态。为了探讨CRC组织甲基化状态异质性,我们选取了最常用的两个CRC早期诊断表观遗传标记物SEPT9和vimentin,采用多区域取样方法(每个肿瘤取3～5个位点),提取肿瘤和正常组织DNA,进行亚硫酸氢盐转化,再联合TA克隆测序法,以正常组织做对照,比较SEPT9基因启动子区和vimentin基因外显子1甲基化状态。结果显示在9号患者,SEPT9和vimentin甲基化率分别为9A未出现甲基化,9B 为 33.3%、4%,9D 位点为 20%、12%,9E 为 40%、33%,但在 9F甲基化比率为40%、3%。在4号患者中,4D甲基化率为20%,32%,4E甲基化率为4%、0,4F甲基化率为18%、12%。这两个标记物均存在不同程度甲基化异质性。且SEPT9基因启动子区甲基化率随着肿瘤恶性程度加大而增高。甲基化异质性在CRC中大量存在。CRC是由遗传因素和环境因素相互作用引起的。而吸烟、饮酒、喝茶、便秘与CRC的相关性仍存在争议。本研究对99例CRC患者和15例健康对照进行分析,探讨这些环境因素与CRC的关联。结果显示吸烟、饮酒和便秘、喝茶与CRC无明显相关性。总之,本研究通过DNA甲基化组学分析、基因突变检测、MSI分析以及特定基因的启动子区甲基化分析,系统研究了中国人群中CRC患者DNA甲基化改变和遗传突变模式,为CRC的预防和治疗提供了科学依据,研究结果具有一定的临床应用前景。