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背景与目的药物性肝损伤(drug induced liver injury,DILI)严重威胁患者用药后的生命安全。对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是临床常用的消炎镇痛药物,在过量使用时可引起急性肝衰竭甚至死亡。APAP造成肝损伤的机制可能有炎症反应、氧化应激、线粒体自噬、内质网应激等机制。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptors,PPARγ)具有调节脂质代谢、调节免疫、抗肿瘤等生理功能,对多种因素引起的肝损伤具有保护作用。噻唑烷二酮类药物(troglitazone,TZDs)是PPARγ的配体,可以与PPARγ结合并激活PPARγ信号通路。已有多篇文献报道,PPARγ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)具有抗炎及抗氧化应激的作用,但RSG是否可以减轻APAP急性肝损伤时的炎症及氧化应激反应尚不清楚。本研究拟在建立APAP诱导急性肝损伤动物模型的基础上,观察RSG对APAP诱导急性肝损伤的保护作用,并从炎症反应、氧化应激机制方面初步探讨RSG对APAP急性肝损伤保护作用的机理。方法1.为观察RSG对APAP急性肝损伤的保护作用,随机将健康雄性CD-1小鼠分成10组,每组6只,共60只。正常对照组:正常饲养,在APAP组给药的同时用生理盐水腹腔注射;单纯RSG组:在APAP组给药前48h、24h及1h分别予以RSG(20mg/kg)灌胃,在APAP组给药的同时给予等容积的生理盐水腹腔内注射;APAP组(4组,分别为APAP 0h组、APAP 1h组、APAP 4h组及APAP 24h组):单次给予APAP(300mg/Kg)腹腔注射;RSG+APAP组(4组,即RSG+APAP 0h组、RSG+APA P1h组、RSG+APAP 4h组及RSG+APAP 24h组):在腹腔注射APAP前48 h、24h和1h予以RSG(20mg/kg)各灌胃一次。APAP组及RSG+APAP组分别在APAP给药后0h、1h、4h、24h剖杀小鼠。所有小鼠在APAP给药前禁食12 h。收集血清检测ALT、AST、CRP和TBIL水平;部分肝脏组织行HE病理检查及凋亡检测。2.为研究RSG对APAP诱导的急性肝损伤小鼠生存率的影响,随机将小鼠分为两组,每组10只。APAP组及RSG+APAP组处理方法同方法1。观察两组小鼠在1周内每天的生存个数,绘制生存曲线。3.为观察RSG对APAPⅠ相代谢酶CYP2E1的影响,随机将小鼠分成4组,每组6只,即正常对照组、RSG组、APAP组、RSG+APAP组,处理方法同方法1,在APAP处理后0.5h剖杀各组小鼠,取肝脏组织用Western blotting法检测CYP2E1的表达。4.为观察RSG对APAP急性肝损伤的肝脏组织GSH代谢酶活性的影响,随机将小鼠分成4组,每组6只,共24只,即正常对照组、RSG组、APAP组、RSG+APAP组,处理方法同方法1,在APAP给药后1h剖杀各组小鼠,取新鲜肝组织检测谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GSH-Rd)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的酶活性。结果1.RSG对APAP急性肝损伤的保护作用从APAP给药后1h开始,血清ALT、AST水平即进行性升高。血清TBIL水平从APAP处理后4h开始进行性升高。RSG预处理后,血清ALT、AST及TBIL水平较同时段单纯APAP组有不同程度的降低。HE染色结果显示,在APAP 1h组,肝脏开始出现淤血水肿;APAP4h组有明显的肝细胞点状坏死、桥接坏死及亚大块坏死;在APAP 24h组出现明显的大块状坏死。用TUNEL技术检查发现,在APAP 1h组,可见有少许肝胞凋亡;APAP 4h组,其凋亡阳性细胞数则明显增加,在24h达到最高峰。RSG预处理的APAP组,肝细胞的变性、坏死程度及坏死面积均较同时段单纯APAP组轻,且凋亡阳性细胞数也明显低于同时段单纯APAP组。单纯APAP组小鼠7日生存率为50%,明显低于RSG预处理组(80%)。3.RSG对APAPⅠ相代谢酶CYP2E1的代谢的影响APAP急性肝损伤时CYP2E1的表达并未发生明显变化,RSG也不影响急性APAP急性肝损伤时的CYP2E1的表达。4.RSG对APAP急性肝损伤炎症反应的影响4.1 RSG对APAP急性肝损伤模型的血清C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的影响与对照组相比,APAP组在4h后血清CRP表达开始轻度升高,在24h达高峰;用RSG预处理可以降低APAP造成的CRP升高水平。4.2 RSG对APAP急性肝损伤时有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响用Western-blotting技术,对MAPK亚家族成员JNK、ERK1/2、P38MAPK及AKT的磷酸化水平进行观察。结果提示,APAP急性肝损伤过程中,上述4种MAPK家族分子均被磷酸化激活。而使用RSG预处理,可以明显下调APAP诱导的上述分子的磷酸化水平。4.3 RSG对APAP急性肝损伤时NF-κB的信号通路的影响用Western blotting技术检测发现,在APAP给药后1h,细胞核内的P65和P50表达增加,并且进行性升高至24h。表明NF-κB在APAP给药后早期即被激活。使用RSG预处理,可以明显下调NF-κB的核表达。4.4 RSG对APAP急性肝损伤时炎性相关因子表达的影响用RT-PCR的方法观察RSG对APAP急性肝损伤时TNFα、KC、COX-2等炎性因子或趋化因子表达的影响。结果发现,与对照组相比,APAP组在出现肝损伤时,细胞因子TNFα、KC的m RNA水平明显增加,而RSG预处理的APAP组,TNFα、KC的m RNA水平明显低于同时段的APAP组。而各组COX-2的转录情况并没有明显差别。5.RSG对APAP诱导肝损伤氧化应激通路的影响5.1 RSG可以减轻APAP导致的还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭2.RSG对APAP诱导的急性肝损伤小鼠生存率的影响在APAP1h组,其肝脏组织中的GSH处于耗竭状态;在APAP4h组,其肝组织中GSH含量较APAP1h组有所上升;在APAP 24h组,GSH几乎恢复至对照组水平。在RSG+APAP 1h组,GSH水平明显高于单纯APAP组;而在RSG+APAP 4h及RSG+APAP 24h组,其肝脏GSH含量与正常对照组无明显差别。5.2 RSG对APAP急性肝损伤的肝脏组织GSH代谢酶活性的影响APAP过量可导致GST、GSH-Rd、GSH-Px三种代谢酶活性降低,RSG可以改善由APAP造成的GSH-Rd的活性减低,对于GST及GSH-Px活降低也有一定的恢复作用,但无明显的统计学意义。5.3 RSG对APAP急性肝损伤脂质过氧化产物表达的影响将肝脏组织进行匀浆后,测定丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量。结果发现,在APAP肝损伤早期(1h)即有MDA含量的明显升高;而在4h后MDA含量及正常组无明显的变化,而使用RSG预处理组各时段其MDA含量均未见明显升高。5.4 RSG对APAP急性肝损伤肝脏组织3硝基酪氨酸(3NT)的影响采用Western blotting技术检测提示,从APAP给药后1h开始,3NT的表达呈进行性增加。而RSG预处理可以明显降低APAP急性肝损伤组织的3NT表达。5.5 RSG对APAP急性肝损伤肝脏组织NADPH氧化酶(NADPH xidase,NOX)表达的影响用Western blotting技术检测发现,从APAP给药后1h开始,NOX-2及NOX-4的表达呈进行性升高,并且与肝损伤的程度相一致。而RSG预处理可以明显降低APAP给药后NOX-2及NOX-4的表达。结论综合以上实验结果,可以得出以下结论:1.RSG对APAP急性肝损伤具有保护作用;2.RSG可能通过抑制炎症反应而发挥其对APAP急性肝损伤的保护作用;3.RSG对APAP急性肝损伤的保护作用可能与抑制氧化应激反应有关。