目的:.(1)通过应用体内脊髓缺血再灌注损伤模型及体外神经细胞缺氧再复氧复糖模型模拟体内缺血再灌注损伤,研究自噬在神经细胞缺血再灌注损伤过程中的作用机制。(2)通过应用JNK抑制剂SP600125,探讨神经细胞体外缺氧再复氧复糖过程中JNK/Beclin-1/Bcl-2信号途径调节自噬的分子机制。(3)通过研究缺血预处理对自噬的影响,探讨缺血预处理保护脊髓神经细胞的分子机制。方法:体外细胞实验:通过改良Takei和Endo的方法分离培养Sprague-Dawley大鼠皮层神经细胞并鉴定。将细胞分为四组:(1)空白组:常规含糖DMEM培养液,37℃、5%CO2空气培养箱中培养细胞;(2)实验组(缺氧缺糖再复氧复糖组):用无糖PBS缓冲液冲洗后去除原培养液,加入2ml无糖DMEM培养液,置37℃培养罐中,持续缓慢通入含有95%N2+5%CO2的混合气体30min,至罐内氧气含量低于1%,密封培养罐4小时,将培养基更换成含糖培养液,并立即将细胞移至37℃,5%CO2空气培养箱中继续培养0.5小时、2小时、6小时及12小时。根据不同复氧复糖时间,进一步分为0.5小时(A组)、2小时(B组)、6小时(C组)及12小时(D组)四组;(3)JNK抑制剂处理组:10μmol/L溶于二甲基亚砜的JNK特异性抑制剂SP600125处理神经细胞0.5小时后按正常方法培养细胞;(4)JNK抑制剂预处理+实验组:应用JNK特异性抑制剂SP600125预处理0.5小时后进行缺氧缺糖再复氧复糖造模,具体分组同实验组。神经元特异性抗体MAP2对细胞进行免疫荧光鉴定;MTT法检测实验各组细胞活性;电镜检测各组中细胞核及线粒体、内质网等细胞器形态,自噬体及自噬溶酶体的形成;Western blot半定量检测各组中LC3I/II、Beclin-1、JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)、Bcl-2及p-Bcl-2(ser70)表达水平;免疫共沉淀检测各组中Beclin-1/Bcl-2的结合状态;细胞免疫荧光定位检测各组中LC3I/II及Beclin-1的表达。动物体内实验:50只成年体重280克-350克Sprague-Dawley大鼠随机分为四组:(1)空白组(5只):仅切开腹腔后缝合,余无特殊处理;(2)缺血再灌注组(20只,根据不同再灌注时间进一步分为4组,每组5只,分别为:A组3小时、B组6小时、C组12小时、D组24小时):肾动脉下端用动脉夹完全夹闭腹主动脉[;30min后,松开动脉夹,关闭腹腔再灌注至预定时间:3小时、6小时、12小时及24小时;(3)单纯预处理组(5只):切开腹腔后反复三次腹动脉夹闭5分钟,松开5分钟后缝合,余无特殊处理;(4)预处理+缺血再灌注组(20只,具体分组同缺血再灌注组):缺血再灌注处理前,予反复三次腹动脉夹闭5分钟,松开5分钟处理,余同对照组。光镜检测各组脊髓标本的形态学改变;神经细胞核染色检测各组脊髓标本中存活神经细胞数量;电镜检测各组脊髓组织中细胞核及线粒体、内质网等细胞器形态,自噬体及自噬溶酶体的形成;Western blot半定量检测各组脊髓标本中LC3I/II、Beclin-1、Bcl-2及p-Bcl-2(ser70)表达水平;免疫共沉淀检测各组脊髓标本中Beclin-1/Bcl-2的结合状态;免疫组化定位检测各组脊髓标本中LC3I/II及Beclin-1的表达。结果:体外细胞实验:Ⅰ)皮层神经细胞鉴定结果显示:培养皿中细胞MAP2染色均为阳性,证实所培养细胞为神经细胞,且纯度达95%以上。Ⅱ)MTT法检测细胞活性结果显示:JNK抑制剂处理组中细胞活性比空白组略低,提示JNK抑制剂对细胞活性有一定影响,但损伤作用极轻微(P>0.05)。随着复氧复糖时间的延长,神经细胞活性在实验组及JNK抑制剂预处理+实验组中均呈逐渐降低的趋势,但实验组的下降幅度明显高于JNK抑制剂预处理+实验组(P<0.05)。在6小时及12小时时,实验组中神经细胞活性下降尤为明显,相对存活率只有29%和13%;而JNK抑制剂预处理+实验组的相对存活率为56%和41%。以上结果表明:缺氧缺塘再复氧复糖造成了神经细胞的损伤,而提前使用JNK抑制剂SP60125可减轻这种损伤。Ⅲ)电镜结果显示:空白组中的神经细胞胞体饱满呈正常形态,核膜、质膜保存完整,线粒体、内质网等细胞器正常聚集未见碎片样分散、肿胀等损伤表现。实验组中,复氧复糖0.5小时后可见大量新月状或杯状自噬前体形成,呈双层或多层膜结构,有包裹胞浆成分的趋势。复氧复糖2小时后,观察到大量双层膜或多层膜结构的自噬体形成,内裹胞浆成分或细胞碎片;但线粒体、内质网等细胞器仍基本正常,未见线粒体肿胀、嵴紊乱减少或内质网肿胀、扩展等变化。复氧复糖6小时后,可见自噬泡与溶酶体结合形成单层膜结构的自噬溶酶体,表现为自噬体与溶酶体初步结合,其内裹的胞浆成分或细胞碎片被逐步降解;同时,胞浆中可见大量新形成的自噬前体。复氧复糖12小时后,细胞核严重固缩、染色质明显边集化;浓缩的胞浆使得其中肿胀的线粒体、内质网等细胞器呈聚集化分布。同时可见自噬溶酶体水解其内容物后留下的空泡,以及大量形成的内裹线粒体、内质网及核糖体等细胞器的新自噬体。JNK抑制剂处理组中的神经细胞胞体稍欠饱满,核膜及质膜略有皱缩,但无明显损伤表现。与实验组相比,JNK抑制剂预处理+实验组中细胞损伤征象明显减轻;各时间点虽均可见自噬体及自噬溶酶体形成,但数量明显少于JNK抑制剂组,且复氧复糖12小时后未见大量新生自噬体。Ⅳ)LC3定位及半定量表达情况:免疫荧光结果显示LC3在空白组及JNK抑制剂处理组中表达极其微弱。实验组复氧复糖0.5小时及2小时后,LC3阳性细胞数量逐渐增多,且胞浆内表达也明显增加(P<0.05)。复氧复糖6小时后,LC3表达略有下降;但12小时后又迅速增加(P<0.05)。与实验组相同,JNK抑制剂预处理+实验组中复氧复糖0.5小时、2小时及6小时后,颗粒状LC3的数量也呈现了先迅速增加后降低的趋势(P<0.05);但12小时后,LC3阳性细胞数量未继续增多。与免疫荧光结果相似,免疫印迹的结果表明:LC3II表达量在实验组和JNK抑制剂预处理+实验组两组间无明显区别(P>0.05),在复氧复糖0.5小时、2小时、6小时处均表现为先增加后降低的趋势。复氧复糖12小时后,LC3II表达量在实验组中迅速增加(P<0.05)而在JNK抑制剂组中只极轻微增强(P>0.05)。Ⅴ)Beclin-1定位及半定量表达情况:免疫荧光结果显示:实验组中,随着复氧复糖时间的延长,Beclin-1阳性细胞数量逐渐增多,表达强度也逐渐增强。而在JNK抑制剂预处理+实验组中,Beclin-1阳性细胞数量直到复氧复糖后12小时才开始增多。免疫印迹结果亦表明Beclin-1表达量在实验组随复氧复糖时间延长而逐渐增加(P<0.05)。JNK抑制剂预处理+实验组中,Beclin-1表达水平直到复氧复糖后12小时才开始增加。Ⅵ)p-JNK及p-Bcl-2(ser70)蛋白印迹检测结果显示:p-JNK(Thr183/Tyr185)和p-Bcl-2(ser70)表达量变化趋势相同,均在实验组中随着复氧复糖时间延长而逐渐增高(P<0.05);而在JNK抑制剂预处理+实验组中被明显抑制,直到12小时后才略有上升(P<0.05)。Ⅶ)免疫共沉淀检测Beclin-1/Bcl-2结合状态:Beclin-1/Bcl-2复合体在实验组中随着复氧复糖时间的延长而逐渐分离(P<0.05),而在JNK抑制剂预处理+实验组中,Beclin-1/Bcl-2复合体的结合相对稳定,直到12小时时才稍有分离(P<0.05)。动物体内试验:Ⅰ)脊髓标本的光镜结果显示:空白组及单纯预处理组中脊髓组织灰质、白质形态正常,间质无出血,组织无浸润等组织坏死现象。脊髓组织在缺血再灌注组3小时处开始出现组织浸润,且随着再灌注时间的延长,在6小时、12小时及24小时处出现多个散在出血灶等晚期组织坏死现象。与缺血再灌注组相比,预处理+缺血再灌注组相同再灌注时间点的脊髓组织损伤明显减轻:脊髓组织在3小时、6小时及12小时中无明显损伤表现,只在24小时才可见组织浸润、点状间质出血等早期组织坏死现象。Ⅱ)神经细胞核染色结果显示:空白组、单纯预处理组中脊髓组织中存活神经细胞数量无统计学差异(p>0.05),分别为:375±16和370±13。随着再灌注时间的延长,脊髓缺血再灌注组中存活神经细胞数量逐渐减少(p<0.05),各时间点分别为:209±6,164±4,112±3和75±2。与缺血再灌注组相比,预处理+缺血再灌注组中各时间点存活的神经细胞数量明显增多(p<0.05),各时间点数量分别为:356±11,348±12,344±11和337±10。Ⅲ)电镜结果显示:空白组、单纯预处理组中脊髓组织无细胞核固缩、染色质边集等凋亡征象,线粒体、内质网等细胞器分布规则,形态饱满无分散肿胀等损伤表现。缺血再灌注组中脊髓组织在3小时处无明显凋亡变化,而在6小时、12小时及24小时处均可见细胞膜皱缩、凹陷,细胞核固缩,染色质边集浓缩,线粒体肿胀、嵴融合消失且多呈聚集化分布,内质网明显肿胀。同时,各再灌注时间点均可观察到大量双层膜或多层膜结构的内裹胞浆成分或细胞碎片的自噬体形成。与缺血再灌注组相同再灌注时间点相比,预处理+缺血再灌注组中脊髓神经细胞损伤程度明显减轻,且各再灌注时间点自噬体的数量明显少于缺血再灌注组。12小时处多见自噬泡与溶酶体结合形成单层膜结构的自噬溶酶体,表现为自噬体与溶酶体的初步结合,可见内裹中的胞浆成分或细胞碎片被逐步降解自噬溶酶体,24小时处则多见内容物已被排空的自噬空泡。Ⅳ)Western blot结果显示:在缺血再灌注组及预处理+缺血再灌注组中,LC3-II、Beclin-1及p-Bcl-2(ser70)的蛋白表达量随着再灌注时间的延长而增加。在相同再灌注时间点,预处理+缺血再灌注组中蛋白表达量明显少于缺血再灌注组(p<0.05)。Ⅴ)免疫共沉淀结果显示:在缺血再灌注组中,Beclin-1/Bcl-2复合体随着再灌注时间延长而逐渐降低。在预处理+缺血再灌注组中,Beclin-1与Bcl-2的结合状态在3小时、6小时、12小时处无明显降低,在24小时处才可见Beclin-1与Bcl-2分离。在相同再灌注时间点,预处理+缺血再灌注组中Beclin-1/Bcl-2结合程度明显强于缺血再灌注组(p<0.05)。Ⅵ)免疫组化结果显示:空白组及预处理组脊髓组织中未见LC3-II和Beclin-1表达。在缺血再灌注组及预处理+缺血再灌注组中,LC3-II和Beclin-1的阳性细胞数量均随着再灌注时间延长而增多。但在相同再灌注时间点,预处理+缺血再灌注组的阳性细胞数量及胞浆内表达量明显少于缺血再灌注组(p<0.05)。结论:(1)脊髓缺血再灌注损伤过程中,Bcl-2蛋白磷酸化水平增高,释放并激活与其结合的Beclin-1蛋白,从而激活脊髓神经细胞自噬性细胞死亡。(2)缺血预处理通过降低Bcl-2蛋白磷酸化水平抑制了Beclin-1/Bcl-2的分离,从而降低Beclin-1的活性,抑制脊髓缺血再灌注损伤过程中的自噬性细胞死亡。(3)神经元体外缺氧缺糖再复氧复糖模拟体内缺血再灌注损伤过程中,神经细胞缺氧缺糖后复氧复糖损伤早期(0.5,2小时)激活的自噬作用为保护神经细胞,而后期(12小时)激活的自噬则与诱导细胞坏死、损伤相关,即自噬性细胞死亡。(4)缺氧缺糖再复氧复糖后期自噬性细胞死亡的激活与p-Bcl-2(ser70)表达量增加造成Beclin-1/Bcl-2分离,释放并活化Beclin-1相关。(5)JNK/Beclin-1/Bcl-2信号调节可能是缺氧缺糖后复氧复糖诱导神经细胞自噬性细胞坏死的机制之一。