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研究背景:糖尿病创面是糖尿病的常见并发症之一,目前糖尿病创面的发病率呈逐年上升趋势,发病人数约占糖尿病患者总人数的1/4。糖尿病创面局部过度的炎症反应、血管再生受损、细胞外基质异常积聚和创面上皮化受损是糖尿病创面组织显著的病理生理变化,致使糖尿病创面不能及时有序恢复为正常的皮肤结构和功能,常导致顽固性机体感染或（和）截肢。即使医疗人员采取严格的血糖控制和精细化的创面护理,糖尿病创面的预后依然较差,影响其愈合的关键问题之一是糖尿病创面血管再生的受损。环状RNA（Circular RNA,circRNA）是一种内源性非编码RNA,广泛存在于真核生物的细胞内。它是通过RNA选择性或反向剪接产生,由外显子和（或）内含子组成,具有共价闭合环状结构,比线性RNA更加稳定。circRNAs已被证实在多种疾病的发生发展中起重要作用,可以作为miRNA海绵竞争性结合miRNA,进而影响miRNA下游靶基因的表达。越来越多的证据表明环状RNA（circRNAs）和小分子RNA（miRNAs）参与肿瘤和内分泌及代谢相关疾病的发生和发展。然而在糖尿病创面愈合或血管受损再生中,关于circRNAs、miRNAs表达及竞争性内源性RNA（ce RNA）网络综合分析少有报道。本研究通过对糖尿病创面中的circRNAs和miRNAs的表达情况进行综合分析,筛选出异常表达且与血管化相关的miRNAs和circRNAs进行验证,并行ce RNA网络图分析,然后应用血管内皮细胞体外培养、过表达质粒构建、Transwell实验、CCK-8、细胞凋亡实验、划痕实验、小管形成实验、双荧光素酶报告基因实验等方法,观察hsa＿circRNA＿000554对下游miRNA生物学功能的影响,并初步探究hsa＿circRNA＿000554在糖尿病创面血管再生中可能的分子机制。第一部分糖尿病创面中circRNAs的表达谱分析目的:筛选糖尿病创面与正常皮肤组织circRNAs的差异表达,并对差异表达的circRNAs进行生物信息学分析,为寻找糖尿病创面血管再生中可能的分子机制提供基础。方法:收集16例糖尿病患者的创面组织和正常皮肤组织,采用circRNA表达谱芯片技术,获取糖尿病创面组织和正常皮肤组织中circRNAs的表达谱,筛选出表达上调或下调倍数大于2的的circRNAs,用生物信息学软件Target Scan、mi-Randa和mirbase对差异表达的circRNAs进行GO和KEGG分析,寻找circRNAs在糖尿病创面愈合中明显富集的信号通路。使用q RT-PCR检测糖尿病创面中表达差异较显著的circRNAs的表达变化。结果:CircRNA芯片结果显示,共有356个表达差异倍数大于2的circRNAs,其中表达上调的circRNAs有157个,表达下调的circRNAs有199个。差异表达circRNAs的GO和KEGG分析结果显示,与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体（AGE-RAGE）、急性髓系白血病、RNA转运、B细胞受体信号通路、人巨细胞病毒感染、血管平滑肌收缩相关通路有关。这些差异表达的circRNAs的宿主基因在人类疾病中主要与癌症、感染性疾病、内分泌与代谢相关疾病、神经退行性疾病等相关,在机体系统中与内分泌系统、免疫系统、神经系统及发育等相关性较高,在细胞过程中与细胞的增殖与凋亡、细胞群落真核生物、以及细胞的运输分解代谢明显相关,在环境信息处理方面与信号转导和信号分子与相互作用有关,在遗传信息处理方面与转化有关,在新陈代谢方面与分布有关。此外,KEGG分析表明失调的circRNAs与血管平滑肌收缩相关通路及肌动蛋白细胞骨架的调节有关。对表达上调的circRNA-001588、circRNA-104330和表达下调的circRNA-000554,circRNA-101280、circRNA-100451、circRNA-103107进行了q RT-PCR检测。结论:糖尿病创面和正常皮肤组织中circRNAs存在表达差异,失调的circRNAs与与血管平滑肌收缩相关通路及肌动蛋白细胞骨架的调节有关。基于这些数据,这些circRNAs的生物学功能可能有助于糖尿病慢性创面血管再生的研究。第二部分糖尿病创面中miRNAs的表达谱分析目的:筛选糖尿病创面与正常皮肤组织miRNAs的差异表达,并对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析,为寻找糖尿病创面血管再生中可能的分子机制提供基础。方法:收集16例糖尿病患者的创面组织和正常皮肤组织,采用RNA高通量测序技术,获取糖尿病创面组织和正常皮肤组织中miRNAs的表达谱,筛选出表达上调或下调倍数大于2的的miRNAs。用生物信息学软件Target Scan、mi-Randa和mirbase对差异表达的miRNAs进行GO和KEGG分析。使用q RT-PCR检测糖尿病创面中与血管化相关的7个miRNAs的表达变化。对与糖尿病创面血管形成有关的11个circRNAs和48个miRNAs做ce RNA网络图分析。结果:测序结果显示,共有42个表达差异倍数大于2的miRNAs,其中表达上调的miRNAs有2个,表达下调的miRNAs有40个。对表达异常的hsa-miRNA-223-3p、hsa-miRNA-144-3p和hsa-miRNA-203a-3p、hsa-miRNA-205-5p、hsamiRNA-200c-3p、hsa-miRNA-141-3p和hsa-miRNA-514a-39进行了q RT-PCR检测。42个miRNAs的GO和KEGG分析结果显示,其主要与细胞间代谢调节、代谢调节、生物正性调节、细胞解剖结构形态形成、神经系统发育、正性代谢调节、细胞间信号转导调节、DNA结合转录因子活性、胞内金属离子结合、阳离子结合、转录因子活性调节、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、细胞内转移酶活性、蛋白结合等生物学功能相关,且多参与NOD-like receptor signaling通路、Fanconi anemia通路、TNF signaling通路、Cysteine and methionine metabolism、Autophagy、ECM-receptor interaction、Phosphatidylinositol signaling system、NF-kappa B signaling通路、Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells、Cell adhesion molecules（CAMs）、TGF-beta signalin等通路的调节。ce RNA网络图显示,hsa＿circRNA＿000554可特异性结合miR-144-3p,hsa＿circRNA＿100141和hsa＿circRNA＿103107可竞争性结合miR-203a-3p,hsa＿circRNA＿001588、hsa＿circRNA＿104330可共同竞争于miR-514a-3p结合位点,hsa＿circRNA＿100926、hsa＿circRNA＿100927和hsa＿circRNA＿101280可竞争性结合miR-429。结论:糖尿病创面和正常皮肤组织中miRNAs存在表达差异,且多参与NOD-like receptor signalingpathway、Fanconi anemiapathway、TNF signalingpathway、Autophagy、ECM-receptor interaction、NF-κB signaling pathway、Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells、TGF-βsignaling pathway等的调节。异常表达的circRNAs和miRNAs相互之间存在网络调控关系。第三部分hsa＿circRNA＿000554调控糖尿病创面血管再生的机制研究目的:探讨hsa＿circRNA＿000554通过miR-144-3p/VEGF-A轴调控血管内皮细胞再生的机制。方法:进行双荧光素酶报告基因实验,验证hsa＿circRNA＿000554与miR-144-3p,miR-144-3p与VEGF-A的特异性结合。构建过表达hsa＿circRNA＿000554质粒和空白对照质粒转染血管内皮细胞,应用q RT-PCR检测两组细胞内hsa＿circRNA＿000554、miR-144-3p和VEGF-A的差异表达情况。应用q RT-PCR检测VEGF-A在miR-144-3p模拟物转染的血管内皮细胞中的表达水平。应用q RT-PCR检测VEGF-A在空白对照组、过表达hsa＿circRNA＿000554组、过表达hsa＿circRNA＿000554+miR-144-3p mimic共转染组的血管内皮细胞中的表达水平（即回复实验）。采用CCK-8、Transwell迁移实验、细胞凋亡实验和小管形成实验等明确hsa＿circRNA＿000554对血管内皮细胞增殖、迁移、凋亡和体外成管能力的影响。结果:通过双荧光素酶报告基因实验,验证hsa＿circRNA＿000554和miR-144-3p可以特异性结合。与空白对照组相比,过表达hsa＿circRNA＿000554组hsa＿circRNA＿000554表达显著升高,miR-144-3p表达显著降低,VEGF-A表达显著升高（p＜0.01）。与miR-144-3p mimic NC组相比,miR-144-3p mimic组VEGF-A的表达显著下降（p＜0.05）。与空白对照组相比,hsa＿circRNA＿000554过表达导致VEGF-A的表达显著提高（p＜0.01）,miRNA-144-3p mimic回调了hsa＿circRNA＿000554过表达对VEGF-A表达的影响（p＜0.001）。与对照组相比,hsa＿circRNA＿000554过表达促进了血管内皮细胞的增殖、迁移、体外血管形成能力,并抑制细胞凋亡（p＜0.05）。结论:差异表达的hsa＿circRNA＿000554特异性结合miR-144-3p,miR-144-3p能够特异性结合VEGF-A,hsa＿circRNA＿000554可通过调控miR-144-3p改变血管内皮细胞VEGF-A表达,从而影响血管内皮细胞的增殖、迁移及体外血管形成。hsa＿circRNA＿000554/miR-144-3p/VEGF-A轴可能是影响糖尿病创面血管再生的一个调控机制。全文结论:1.与正常皮肤组织相比,糖尿病创面中差异表达的circRNA和miRNA多参与AGE-RAGE、NF-κB、Wnt/β-Catenin等信号通路的调节,与糖尿病创面血管形成关系密切。2.过表达的hsa＿circRNA＿000554促进了体外培养的血管内皮细胞的增殖、迁移及血管形成,抑制血管内皮细胞凋亡。hsa＿circRNA＿000554可通过调控miR-144-3p,改变细胞内VEGF-A含量,影响糖尿病创面血管再生的过程。