肠道病毒71型,与脊髓灰质炎病毒、卡萨奇病毒及埃克病毒同属肠道病毒属,因其首次从1969年加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的患儿粪便标本中分离发现之时,按照肠道病毒先后排列顺序,排名71位,故被命名为肠道病毒71型,简称EV71。EV71是一种单股正链RNA病毒,它同CoxA16和CoxA10一起被公认为是引起HFMD的主要病原。与柯萨奇病毒的致病性不同,EV71能引起包括中枢神经系统疾病在内的多种并发症。目前众所周知的,感染EV71会导致脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹等多种与神经系统相关的疾病。自上个世纪七十年代首次报道手足口病以来,至今已在世界范围内引起多次爆发与流行;近十年来,我国大陆及台湾等周边地区EV71疫情日趋严重,儿童感染后易引起严重并发症,病死率高,死亡速度快,造成了社会的不安定。人是EV71唯一的宿主,EV71的流行一年四季均可出现,常见于夏秋季,主要侵犯6岁以下婴幼儿,幼儿园等人群密集处是EV71流行和暴发的主要场所,它的主要传播方式是粪口传播。但近年来亚太地区的流行情况显示,EV71病毒也可通过呼吸道传播;而目前呼吸道的飞沫传播已被认为是引起疾病流行的重要传播方式。自1969年在加利福利亚的脑炎婴儿的粪便中首次发现EV71病毒后,随后福利亚和纽约于1972年在EV71引起神经系统感染的病例中真正分离出该病毒。EV71感染在澳大利亚、日本、匈牙利、马来西亚、新加坡、台湾等地区也多次暴发;1999年以来,我国大陆地区也相继报告了EV71感染的局部流行,但与1998年台湾地区有所不同,大陆所流行的由EV71引起的HFMD和神经系统症状都较轻。由于不同时期、不同地区发生的EV71型感染往往呈现不同的流行特点,临床特征等都有着不同程度的差异,因此进一步的流行病学研究十分必要。EV71结构蛋白主要是由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白构成,其中,VPl基因最具研究意义。首先,VP1蛋白暴露于病毒表面,成为主要的病毒中和决定因子, EV71病毒的抗原性就是由VP1蛋白决定的;其次,VP1基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性。本实验通过收集2009年西安市西京医院儿科HFMD的患儿的疱液、咽拭子,进行病毒分离及RT-PCR技术,从而获取EV71的VP1目的基因,将其与PQE30载体连接,构建出质粒,并对EV71西安地方株VP1基因进行遗传学研究,为EV71西安地方株特性的研究以及EV71地区性的预防和控制工作的开展打下坚实的基础。研究目的本实验首先将收集到的EV71阳性标本进行病毒分离和RT-PCR检测,通过RT-PCR扩增EV71外壳蛋白VP1基因,构建重组表达质粒PQE30/VP1 ,转化大肠杆菌BL21中,进行测序,对VP1基因分析,并与标准株阜阳株(序列号为EU913471)比较,进行核苷酸同源性分析;其次,选用6周龄BALB/c小鼠,经鼻腔接种,对其用有明显细胞病变的病毒液进行感染,通过分子生物学方法检测小鼠的各组织的感染情况,了解肠道病毒71型的感染特点。通过2008年4月至2009年3月449例西京医院门诊及住院患儿的疱液及咽拭子标本行EV71初步筛查,对其结果从季节、年龄、性别进行统计学分析,并结合阳性患儿临床特征,对西安地区EV71感染的流行病学特征进行初步研究。实验方法(1)采集西安地区手足口病患儿的疱液、咽部分泌物进行病毒分离和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测;通过RT-PCR扩增肠道病毒71型( EV71)外壳蛋白VP1基因,构建重组表达质粒PQE30/ VP1 ,转化大肠杆菌BL21中,对VP1基因进行初步分析。(2)通过滴鼻EV71感染BALB/c小鼠,观察经呼吸道感染后小鼠的感染状况,并采集各器官组织进行病理切片光镜检测、病毒RNA检测、病毒分离及鉴定,了解经呼吸道感染EV71的临床特点和各器官病毒分布情况。(3)根据西安地区EV71感染流行期间数据和实验室检测结果进行流行病学回顾性研究,实验结果(1)对肠道病毒71型( EV71)西安地方株VP1基因测序,并将其与阜阳株(序列号为EU913471)相比较,表明西安地区EV71分离株其核苷酸有1处一个碱基的插入(10)和1处三个碱基的插入(170一172)。(2)实验组动物感染后5天,与空白对照组相比,出现了消瘦(每只小鼠体重减少约2-3g不等),精神萎靡,活动减少,但无严重症状。病毒RNA PCR检测结果,肺、血液、肠均为阳性,而脑和心未见阳性条带。肺、肠病理切片光镜显示有病变,脑、心脏显示无病变;组织PCR阳性组织RT-PCR方法鉴定,结果均阳性。(3)人群分布:在36例阳性病例中,①性别比:男性23例,女性13例,男女性别比1.77:1。②年龄分布:6岁以下阳性例数占总数的94.4%。时间分布西安地区2009年EV71感染最早发病时间为3月底4月初,其高峰期在春季4～5月,春季阳性率13.5%,明显高于其余各季节(P<0.05,有统计学意义)。结论(1)通过EV71的VP1基因测序结果表明,西安地方株VP1基因与阜阳株相比,其核苷酸存在一定差异。与EV71标准株BrCr、深圳株相比,在核苷酸同源性也都有不同程度的差异,通过使用原核表达系统初步构建西安地区EV71外壳蛋白VP1,为西安地区EV71抗体检测以及EV71的病毒预防和控制等工作的开展,打下一定的基础。(2)在实验中发现,感染了EV71的小鼠,临床表现轻微,并没有出现典型的竖毛、弓背等临床症状,更没有出现四肢麻痹及死亡等严重并发症;EV71直接感染了肺、小肠及血液,但并未到达中枢神经系统及心脏。这一实验结果从另一个侧面反映了西安地区EV71感染的基本特征,为西安地区EV71感染的研究奠定基础。(3) EV71感染不同地点和不同时间,其流行病学特征有着明显的不同。西安地区EV71感染的临床表现与1998年的台湾、2004年的深圳、2007年的山东以及2008年的安徽阜阳的严重病例相比,主要引起上呼吸道感染,无严重并发症及死亡病例。感染高峰期,以春季为主,这一结果与2008年阜阳EV71的流行极为相似。