论文部分内容阅读
前期研究工作中,鉴定获得华癸中慢生根瘤菌7653R共生固氮相关新基因RGS1,其突变表型证实RGS1突变株形成固氮活性显著降低的无效根瘤。但是其作用机制尚未阐明,值得深入探究。本文在延续研究中,取得了如下实验结果。生物信息学分析发现RGSl在7653R质粒上存在5个拷贝,均位于结构基因间隔区；RGS1折叠形成3个以上的茎环结构；这些特征与已报道sRNA(small RNA)相符合。同时,基于分析预测的RGS1两个候选的完整ORF,我们分别进行了蛋白表达纯化和抗体制备。但是Western杂交显示：7653R在自生和共生条件下均无预测大小的目标蛋白表达,从而表明RGS1不是以转录因子或功能基因发挥作用。为了解RGS1在7653R总RNA中是否有RNA表达及其表达方向,设计了两个方向的引物进行RT-PCR,结果显示RGS1在两个方向上均有转录产物表达。进一步的Northern杂交发现：在厌氧和共生条件下RGS1以“-”链为模板表达大小约250bp的片段；RGS1以“+”链为模板在厌氧和共生条件下未检测到阳性信号,而在自生和胁迫条件下检测到大小为100bp和200bp的杂交信号。综上所述,结果表明RGS1为一种sRNA,且在不同的链上均有表达,受到不同环境条件的诱导。采用5’和3’RACE方法,对RGS1全长进行了扩增和测序,获得了106bp和49bp的两段扩增产物。采用Real-time PCR,检测了“-”链为模板时RGS1在7653R不同生理阶段的表达丰度。发现在培养条件下RGS1基本不表达,但在不同时期根瘤类菌体中RGS1的表达量逐渐升高,在第28天时达到最高水平。该结果表明“-”链编码的RGS1是7653R共生固氮特异性表达的基因,受共生条件的诱导。采用Real-time PCR比较测定了野生型和突变株中RGSl上下游结构基因的表达量。结果显示在自生、厌氧和共生状态下突变株中RGS1上下游结构基因表达量均显著下降,表明RGS1可能直接参与调控上下游基因的转录和翻译。进一步通过Northern杂交对RGS1前体进行了鉴定,结果表明7653R在自生、厌氧和共生状态下,RGS1所在的转录单元大小发生明显变化。共生状态下表达的转录单元片段更大,但下游结构基因表达是否直接受RGS1调控,还需要进一步以某一结构基因为探针进行该转录单元的检测。