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丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)为单股正链RNA病毒,黄病毒科成员,是经血液传播而引起急、慢性肝炎的主要致病因子之一。目前全球约有1.7亿人感染HCV,每年新发感染者约300万例。HCV慢性感染率高达70%以上,HCV慢性感染在发达国家是导致肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的主要原因。HCV感染还与多种肝外疾病,如淋巴瘤、混合性冷球蛋白血症、肾小球肾炎、迟发性皮肤卟啉症、糖尿病等密切相关。目前全球范围内经血液以及血制品途径感染的丙型肝炎病例与上世纪九十年代以前相比有大幅下降,但在发展中国家血液和血制品仍然是传播HCV的重要途径。此外,每年散发性以及传播途径不明的丙型肝炎新发病例在全球范围内仍高居不下。控制HCV感染的关键措施还依赖于开发出有效的疫苗。从1989年HCV基因组被克隆以来,丙型肝炎疫苗的研究在欧美和日本等发达国家一直是研究热点,但迄今未有有效的疫苗问世。HCV包膜E2蛋白是介导HCV细胞侵入的关键蛋白,该蛋白氨基末端的27个氨基酸是第一个鉴定出的含中和抗体表位的区域,因其序列高变而被称为高变区1(hypervariable Region 1,HVR1),HVRl的高度变异曾被认为是遏制丙肝疫苗发展的瓶颈问题。然而,近几年来基于感染性假HCV颗粒(HCVpp)以及细胞培养产生的HCV(HCVcc)的中和试验表明,HVRl并不是唯一的中和抗体表位所在区域,在HCV包膜E2蛋白中还存在保守的空间构象和线性中和抗体表位。本实验室之前研究HVR1免疫特性时发现:HVR1具有强免疫原性,可高效诱导中和抗体,同时,HVR1非常显著地抑制HCV包膜E2蛋白中保守抗原表位的抗体应答。本研究中,我们进一步从免疫原性和蛋白结构等方面分析HVR1免疫诱饵作用的可能机制,并鉴定出其中的关键氨基酸序列,为认识HCV免疫逃避以及HCV细胞侵入机制提供全新信息,为HCV疫苗的研究提出全新思路。一、HVR1中抑制E2蛋白免疫原性的关键肽段的鉴定方法:1、质粒构建:以1a基因型H77株HCV包膜蛋白基因为原型,构建HVR1中部分氨基酸残基缺失的各种分泌型E2蛋白表达质粒,包括缺失整个HVR1(77Δ)、缺失HVR1第1至12位氨基酸残基(77Δ1-12)、缺失第13至27位氨基酸残基(77Δ13-27)、缺失第16至24位氨基酸残基(77Δ16-24)以及含完整HVR1(77)的5种质粒。2、E2蛋白表达检测:用ELISA、Western blot和免疫荧光检测各种E2蛋白的表达和分泌。3、DNA免疫:将上述质粒肌肉注射免疫Balb/C小鼠。4、抗体检测:用ELISA和免疫荧光检测小鼠血清中的E2Δ抗体、HVR1抗体以及三个已知B细胞表位(412、522、432)的反应。结果:缺失HVR1或其中的部分残基对E2蛋白的表达、分泌及构象无明显影响。含有HVR1或HVR1第16-24位氨基酸的质粒可免疫小鼠诱导产生HVR1抗体,同时抑制E2蛋白中其他表位的抗体应答,而去除第16-24位氨基酸即可消除这种抑制作用。结论:高变区1中的16-24位氨基酸为抑制E2蛋白免疫原性的关键肽段,而该肽段是我们前期鉴定出的H77株HVR1中的唯一B细胞表位。二、HVR1抑制HCV包膜E2蛋白免疫原性的机制研究方法:1、构建质粒:将HVR1移位到E2蛋白羧基末端(77Δ-HC)、在E2羧基末端增加HVR1肽段(77-HC);将HVR1与HBsAg串联(S-HN);将HVR1替换为其他抗原表位HA表位(77HA)。2、将各重组质粒免疫小鼠。3、检测小鼠产生的HVR1抗体、HA抗体、E2抗体以及HBsAg抗体,分析各种抗体水平之间的相关性。结果:1、HVR1的定位不影响其对E2免疫原性的抑制作用。2、HVR1可抑制HBsAg诱导的抗体应答。3、HA表位也能抑制E2的免疫原性。结论: HVR1是免疫优势表位,可抑制HBsAg的免疫原性;E2蛋白其他区域的免疫原性易受HVR1以及HA表位的影响,导致诱导抗体的能力降低。三、免疫血清对病毒的中和作用研究方法:1、将几种代表性质粒(77、77Δ、77Δ13-27)用肌肉注射联合电脉冲免疫新西兰大白兔。2、检测兔血清抗体。3、纯化兔血清中的IgG,分析IgG对HCVpp以及HCVcc的中和活性。结果: 1、质粒77能诱导E2抗体,但其中针对HVR1的抗体占绝对优势;以E2Δ作为抗原检测兔血清,则质粒77Δ、77Δ13-27诱导的抗体显著强于77;2、用不同基因型E1E2为抗原检测兔血清抗体,表明缺失HVR1能显著提高E2蛋白诱导交叉中和抗体;3、HCVpp中和试验表明,77免疫血清的中和作用主要依赖于HVR1抗体,缺失HVR1或HVR1的第13-27位氨基酸能显著促进E2诱导交叉中和抗体。结论:免疫兔得到的结果与免疫小鼠得到的结论是一致的,即HVR1显著抑制E2蛋白中其他抗体表位的免疫原性,用缺失HVR1或HVR1中第13-27位氨基酸的E2蛋白可能是一种有效的丙型肝炎疫苗抗原,其发展前景值得期待。