生物冶金是指利用微生物通过直接或间接作用将矿石中的各种金属溶出并加以回收的技术。与传统的物理化学方法相比,生物冶金技术具有明显的优势。一方面,生物冶金工艺生产成本低、无污染。另一方面,生物冶金可用于低品位、难处理的硫化矿以及尾矿的有效开发与利用。此外,近年来,生物冶金技术的应用已从生物开采拓展到含金属废弃物的资源回收,例如污水污泥和印刷电路板中的金属回收利用等。因此,生物冶金技术在开采低品位矿产资源和处理重金属环境污染方面具有广阔的应用前景。然而,目前对浸矿微生物的生理特性了解不足,生物冶金工业应用的工艺控制条件尚需优化。因此,深入研究生物浸出细菌的生理代谢特性,对于浸矿微生物的浸出机制、高效利用以及生物冶金工艺的优化具有重要的理论意义和应用价值。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）是酸性矿山环境中普遍存在的优势菌株,已被广泛应用于生物冶金和重金属污染物治理中。A.ferrooxidans可通过氧化亚铁或还原性无机硫化物获得能量,是研究细菌-硫化矿相互作用和生物浸出机理的模式细菌。生物冶金过程需要浸矿微生物的协同作用。A.ferrooxidans能够附着在矿石表面,分泌胞外多聚物（extracellular polymeric substances,EPS）形成生物膜,从而在矿石和细菌之间形成反应微空间,为细菌溶解矿石提供适宜环境。EPS合成和生物膜的形成被认为是细菌-矿石相互作用的必要条件,决定了自然环境中矿物质的溶解速度以及工业运营的效率。然而,尚不清楚在极端环境中A.ferrooxidans的协同生长和聚集以形成生物膜并参与生物冶金过程的代谢调控机制。群体密度感应（quorum sensing,QS）系统是细胞间的信号交流通讯系统,细菌通过产生、分泌、识别和检测信号分子（也称为自诱导分子）进行细胞间的交流,感知群体密度和外界环境,调控基因表达。QS系统具有调控细菌EPS和生物膜合成、抗生素合成、孢子形成、共生等多种生理代谢功能。在A.ferrooxidans中发现了由afeI-orf3-afeR操纵子编码的LuxI/R型QS系统（QS-Ⅰ）。其中afeI基因编码信号分子合成酶,属于LuxI家族蛋白,催化合成N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones,acyl-HSLs）。AfeR 是一种转录调节因子,可以识别并结合特定的acyl-HSLs来调节基因表达。orf3基因的功能仍然未知。此外,A.ferrooxidans中还存在另一套QS系统（QS-Ⅱ）,qs-Ⅱ操纵子包含四个基因:编码酰基转移酶的act基因,编码磷酸酶的gph基因,编码甘氨酸t-RNA合成酶α亚基和β亚基的glyQ和glyS基因。QS-Ⅱ系统由于缺少信号分子受体蛋白而备受争议。此外,QS-Ⅱ系统在A.ferrooxidans中的作用仍不清楚。在A.ferrooxidans培养物中检测到9种不同的acyl-HSLs。外源添加acyl-HSLs可以刺激EPS合成和生物膜形成。然而,由于缺乏突变基因的功能研究,QS系统在生长代谢、EPS和生物膜形成以及生物冶金中的调控功能及其分子机制尚不清楚。基于A.ferrooxidans中QS系统的研究现状,本论文针对上述要解决的问题,从以下几个方面开展了研究工作:一.构建了A.ferrooxians两套QS系统关键基因的敲除菌株本论文利用实验室建立的针对嗜酸性硫杆菌的遗传操作体系,首次成功获得了 QS系统相关基因的突变菌株,构建了 QS-Ⅰ系统信号分子合成酶基因afeI基因的敲除,回补与过表达菌株;QS-Ⅰ系统完整基因簇,afeI-orf3-afeR操纵子的敲除、回补与过表达菌株;QS-Ⅱ系统信号分子合成酶基因act基因的敲除、回补与过表达菌株,两套QS系统信号分子合成酶基因afeI和act的双敲除菌株ΔafeI＆act等,共计17株用于两套QS系统研究的突变体,使得在分子水平上揭示QS系统在A.ferrooxidans中的调控功能及其分子机制成为可能。二.揭示了AfeI/R型QS系统基于能量底物对A.ferrooxidans细菌生长代谢和遗传表型的调控功能及其分子机制本论文以基因突变株为研究载体,率先开展了 QS-Ⅰ系统对菌株的生长、能量代谢、EPS合成、硫试片侵蚀、以及基因转录调控的研究。首次发现了 AfeI/R型QS系统依赖于能量底物的调控功能,在不同能源底物培养时,AfeI/R型QS系统对A.ferrooxidans生长的影响呈现多样性:以硫为能源底物时,afeI过表达菌株和qs-Ⅰ操纵子过表达菌株生长和硫代谢均显著高于对照菌株;以亚铁为能源底物时,afeI过表达菌株和qs-Ⅰ操纵子过表达菌株细胞生长和菌体密度均显著低于对照菌株。EPS分析清楚地表明,以硫为能源底物培养时,afeI和qs-Ⅰ操纵子过表达都可以在对数中期促进A.ferrooxidans的EPS合成。而以亚铁为能源底物培养时,afeI和qs-Ⅰ操纵子基因过表达对EPS合成没有明显影响。通过LC-MS-MS技术明确了两种能量底物培养条件下AfeI产生的acyl-HSLs信号分子,发现了其中的两种关键acyl-HSLs（3-OH-C14-HSL和C12-HSL）能够分别影响以硫和亚铁为能源底物培养时A.ferrooxidans的生长。本论文提出了 AfeI/R介导的QS系统依赖于能量底物的调控模型。AfeI/R介导的QS系统利用不同的信号分子促进以硫为能源时细胞的生长、硫代谢和生物膜合成,抑制以亚铁为能源时细胞的生长和亚铁代谢。AfeI/R对能量代谢和细胞密度产生了全局调控作用。因此,AfeI/R介导的依赖于底物的调控模式可能是A.ferrooxidans适应生长环境的重要机制,以使其在有利的环境中获得生态优势,并保持种群与极端酸性环境之间的生态平衡。三、qs-Ⅰ操纵子对多聚磷酸盐代谢的调控及环境胁迫应答机制研究本论文发现了 qs-Ⅰ对多聚磷酸盐（polyphosphate,polyP）合成的调控具有能量底物依赖性,揭示了qs-Ⅰ操纵子在基因转录水平上调控polyP合成和降解的机制。以硫为能源底物培养时,qs-Ⅰ操纵子过表达促进A.ferrooxidans细胞内polyP的积累,qs-Ⅰ操纵子敲除菌株稳定期胞内polyP含量与野生型相比显著下降。qs-Ⅰ操纵子通过调控合成和降解两个途径来调控A.ferrooxidans细胞polyP代谢。qs-Ⅰ过表达引起具有polyP合成功能的多聚磷酸盐激酶ppk1表达上调,具有polyP水解功能的外切聚磷酸酶ppx表达下调。在环境胁迫（硫酸铜和酸胁迫）培养时,qs-Ⅰ过表达同样能促进polyP的合成。以亚铁为能源底物培养时,qs-Ⅰ操纵子基因表达对A.ferrooxidans细胞内polyP的积累没有影响。在不同的环境胁迫（硫酸铜、酸、渗透压）培养时,qs-Ⅰ操纵子过表达菌株表现出生长优势和良好的抗逆性。基因转录水平分析表明qs-Ⅰ操纵子过表达在胁迫环境培养时能够调控抗性基因的表达,调动细胞胁迫应答机制,协调细胞在逆境中的生长。四、QS-Ⅱ系统act基因新功能解析及其分子机制研究A.ferrooxidans的QS-Ⅱ系统2007年被发现,十几年来国际上还没有关于QS-Ⅱ的新的研究发现。本论文利用生物信息学方法,从极端环境微生物的角度分析了QS-Ⅱ的分布情况。通过蛋白序列比对分析发现,Act介导的QS-Ⅱ系统在极端环境微生物中广泛分布、高度保守,表明了act基因在极端环境微生物中存在重要的未知生物学功能。本论文以构建的act基因突变菌株为研究对象,展开了act基因对A.ferrooxidans生长、能量代谢、抗逆性等多种生理代谢功能以及转录调控功能的研究。首次发现了act基因对菌株生长的影响与QS-Ⅰ系统afeI的作用不同,以硫为能源底物培养时,Act介导的QS-Ⅱ系统影响稳定期细胞生长和菌体浓度,act敲除菌株稳定期菌体浓度显著下降,而过表达菌株稳定期菌体浓度显著提高。本论文阐明了act基因具有调控A.ferrooxidans重金属胁迫应答的功能。act敲除菌株在二价重金属离子（Cu2+、Cd2+）胁迫条件下几乎不能生长,act回补菌株在重金属胁迫条件下生长得到恢复,act过表达菌株在重金属胁迫条件下比对照菌株具有明显的生长优势。转录组数据分析揭示了act基因敲除和过表达引起了重金属胁迫相关基因的差异表达,进而影响了act突变菌株的重金属耐受性。本论文揭示了两套QS系统的关系,QS-Ⅰ和QS-Ⅱ在A.ferrooxidans的生长调控过程中具有协同效应。AfeI/R介导的QS-Ⅰ系统对菌株生长代谢的调控主要体现在延迟期和对数生长期,而Act介导的QS-Ⅱ对菌株生长代谢和菌体密度的调控主要体现在稳定期。QS-Ⅰ和QS-Ⅱ系统相互协同,实现了对A.ferrooxidans整个生长周期的调控。此外,以硫为能源底物培养时,act过表达菌株提高了稳定期菌体浓度,但是在缺失了QS-Ⅰ系统整个基因簇的情况下,act基因过表达没有对生长产生影响,表明了 Act介导的QS-Ⅱ系统对生长的调控作用需要QS-Ⅰ系统的参与。五、利用QS系统理论研究成果指导A.ferrooians浸矿应用的研究本论文首次将QS系统的理论研究成果用于黄铁矿浸出实验,探讨了生物浸出过程中QS-Ⅰ系统突变菌株与矿石的吸附、表面相互作用和浸出作用,证实了qs-Ⅰ操纵子对细菌吸附、矿石侵蚀和金属溶解浸出的重要作用,提出了基于QS系统改良浸矿微生物,提高浸矿效率的新策略。本论文的研究构建了A.ferrooxindas两套QS系统相关基因的突变菌株,观察和分析了两套QS系统在不同能源（亚铁能源和硫能源）底物培养时,对A.ferrooxidans生长代谢和遗传表型的影响,揭示了QS系统能量底物依赖性的调控方式和分子机制。本论文的研究结果丰富和深化了对A.ferrooxidans QS系统的调控功能及其分子机制的认知,提出了基于QS系统改良浸矿微生物,优化生物冶金工艺控制参数,提高浸矿效率的新策略,为指导工业应用提供了重要的理论依据。