Ser/Thr和Tyr磷酸化在动物和酵母细胞的生长发育过程中都起重要的作用,但在植物细胞中仅确立了Ser/Thr磷酸化作用。到目前为止,植物细胞中还没有发现典型的酪氨酸蛋白激酶(Proteintyrosine kinase,PTK),因而忽视了对植物体内酪氨酸磷酸化作用的研究。最近的资料表明植物体内确实存在一些酪氨酸磷酸化蛋白(Phosphotyrosyl protein,PYP)和酪氨酸蛋白磷酸酶(proteintyrosine phosphatases,PTPases),因此在植物体内确立酪氨酸磷酸酶的功能具有重要意义。植物叶片表皮细胞上的气孔是由围绕小孔周围的一对保卫细胞组成的。气孔的开和关主要是通过大量的离子流进出保卫细胞使其膨压改变而调节的,它已成为研究植物细胞信号转导的一种模式材料。由于保卫细胞和周围表皮细胞不同,能够对各种内源信号和外界刺激产生迅速而可逆的反应,使植物能够适应环境,优化生长,因此保卫细胞的信号转导引起人们的浓厚兴趣。本研究以蚕豆叶片气孔保卫细胞为材料对PTPases参与气孔运动的调控及其作用机制进行了探索。保卫细胞质膜H+-ATPase在调节气孔张开的过程中起着关键的作用,但关于其抑制剂NaVO3在抑制气孔张开方面存在一些矛盾的结果。在实验中,我们观察到NaVO3几乎不能抑制光诱导的蚕豆气孔张开,却可以抑制黑暗和ABA诱导的气孔关闭。由于气孔开放是通过H+-ATPase的激活而不是抑制实现的,所以NaVO3对黑暗和ABA诱导的气孔关闭的抑制作用显然不是由于对H+-ATPase抑制的结果。鉴于NaVO3是哺乳动物系统中PTPases的抑制剂,最近的资料证明在植物中也存在PTPases,那么NaVO3对气孔运动的调节不同结果是否通过对PTPases活性调节实现的呢?本实验观察到PTPases专一性抑制剂,氧化苯胂(phenylarsine oxide,PAO)对气孔运动的影响与NaVO3有类似的效应,但其对气孔运动的调节作用比NaVO3要强烈的多。PAO可以抑制黑暗和ABA诱导的气孔关闭效应,并且可以使已经关闭的气孔重新张开。但PAO对光诱导的气孔张开几乎没有影响。二价Zn2+作为PTPases的一种抑制剂也可以部分抑制黑暗和ABA诱导的气孔关闭过程。实验结果初步证明PTPases参与蚕豆气孔关闭信号过程的调控。在蚕豆表皮检测到的PTPases酶活性:该酶活性最适pH在6. 0-7. 0之间,pH超过7. 5,其活性大大降低;PAO和NaVO3都可抑制该酶的活性:不同浓度的二价金属离子Ca2+和Mg2+对蚕豆表皮细胞中的PTPases几乎没有任何影响,但不同浓度的Zn2+可以抑制其酶活性,这一结果与Zn2+作为PTPases一种抑制剂,抑制ABA和黑暗诱导气孔关闭效应相一致。氧化还原条件也影响蚕豆表皮细胞的PTPases酶活性:PAO和H2O2都可以有效抑制蚕豆表皮PTPases的活性,加入还原剂DTT不能减弱PAO对PTPases的抑制作用,但可以解除H2O2对PTPases的抑制作用,即H2O2可使PTPases发生可逆失活。PTPases作用的底物应该是一些酪氨酸磷酸化的蛋白。使用anti-phosphotyrosine antibodyPT-66对保卫细胞中酪氨酸磷酸化蛋白进行的免疫荧光和免疫胶体金电镜定位的结果表明,在保卫细胞的细胞核、胞质、液泡、质膜和叶绿体中都有酪氨酸磷酸化蛋白的分布,其中细胞核和叶绿体中分布较多。表明PTPases对气孔运动的影响是多条途径相互交叉综合作用的结果。H2O2是ABA诱导气孔关闭的下游信号组分之一,但是对保卫细胞是如何调节并感知ABA诱导H2O2的产生这一信号过程的细节知之甚少。PTPases专一性抑制剂PAO不仅阻止ABA或HZo:诱导的蚕豆气孔关闭,也可以使ABA或HZO:诱导关闭的气孔重新张开,说明PTPases可能在HZO:的下游调节ABA诱导的蚕豆气孔关闭过程。队O也可抑制ABA诱导的蚕豆保卫细胞中HZo:的产生,MAPK专一性调节ABA诱导保卫细胞中HZo:的产生,不论在动物还是植物中,MAPK都是PTPaseS作川的一个土要靶位,推测PTPases可以.通过对MAPK的作用来调控ABA诱导的HZO:的产生。 本研究中我们证明NavO3对气孔运动作用的矛盾实验结果可能是其影响PTPases的原因;PTPases主要参与气孔关闭信号过程的调控,抑制该酶的活性,阻断气孔的关闭过程,并能使关闭的气孔重新张开:并提出PTPases调控气孔运动信号转导的可能作用模式:PTPases既可以影响保卫细胞中ABA诱导产生HZO:的信号调一竹,又可能作为日20:的感受因子,感知产生的氧化还原信号,进一步放大、传递信号,最终导致气孔关闭。关键词:酪氨酸磷酸化作用;酪氨酸蛋白磷酸酶;ABA;气孔运动;HZOZ;信号转导; 蚕豆(巧eiafaba L.)