论文部分内容阅读
本试验在体外成熟培养液中添加EGF和IGF-Ⅰ，研究其对牛卵母细胞核及胞质成熟的作用，并通过孤雌激活来检测EGF和IGF-Ⅰ对牛卵母细胞胞质成熟的影响；同时以牛乳腺上皮细胞为核供体，以牛MⅡ期卵母细胞为核受体，以电融合法构建重构胚，通过比较不同的电场强度、脉冲时长、供体细胞的不同处理方式以及不同的融合液组成等，系统的研究了不同因素对重构胚融合效率的影响，旨在优化融合程序，提高重构胚的电融合率和重构胚的发育率。试验结果如下：
1.在成熟培养液中分别添加0，10，50，100ng/mL的表皮生长因子(EGF)，24h检查成熟率，在含5μmol/L离子霉素的CR1aa培养液中处理5min，然后在含2mmol/L6-DMAP的CR1aa培养液中培养4h，用CR1aa培养液洗三次后进行分组培养，48h检查卵裂率，7～8天检查囊胚发育率。结果表明，添加EGF能够提高卵母细胞的体外成熟，促进孤雌激活胚卵裂率和囊胚发育率，以添加50ng/mL时的成熟率、卵裂率和囊胚发育率最高，分别为78.28％、86.50％、24.81％同对照组(65.05％、73.68％、10.20％)相比差异显著(P＜0.05)，表明添加50ng/mL的EGF，无论是对卵母细胞成熟的促进，还是对孤雌胚卵裂率和囊胚发育率都可以得到理想的效果。
2.在成熟培养液中分别加入0，10，50，100ng/mL的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，观察成熟率、孤雌胚的卵裂率和囊胚发育率。添加IGF-Ⅰ能够促进卵母细胞的体外成熟，提高孤雌胚的卵裂率和囊胚发育率，以添加100ng/mL时的成熟率、卵裂率和囊胚发育率最高，分别为76.67％、83.85％、20.74％同对照组(65.05％、73.68％、10.20％)相比差异显著(P＜0.05)。结果表明添加100ng/mL的IGF-Ⅰ能够促进牛卵母细胞的体外成熟，同时也能够提高孤雌胚的卵裂率和囊胚发育率。
3.在体外成熟过程中分别加入50ng/mLEGF，100ng/mLIGF-Ⅰ或者50ng/mLEGF/100ng/mLIGF-Ⅰ，观察成熟率、孤雌胚的卵裂率和囊胚发育率。EGF/IGF-Ⅰ能够促进卵裂率和囊胚发育率，分别为86.15％、87.05％、28.21％，同对照组相比差异极显著(P＜0.01)，同单独添加EGF和IGF-Ⅰ组相比差异不显著(P＞0.05)，表明EGF/IGF-Ⅰ能够促进牛卵母细胞的体外成熟，提高孤雌胚的卵裂率和囊胚发育率。
4.用不同电场强度2.0、2.4、2.8kv/cm，其他参数为20μs，2次脉冲，10ms不变的情况下，观察电场强度对重构胚融合率及早期发育的影响。结果表明，不同电场强度对融合率的影响显著(P＜0.05)，以2.4kv/cm融合效率(55.77％)最好。
5.用不同脉冲时长10μs、20μs、30μs，其它参数2.4kv/cm，2次脉冲，10ms不变的情况下，观察其对重构胚融合率及早期发育的影响。结果表明，不同脉冲时长对融合率的影响显著(P＜0.05)，以20μs融合效率最好。
6.在液氮(-196℃)冷冻保存细胞解冻后直接用做核供体细胞以及未经冷冻保存过的新鲜细胞直接用于核供体，观察对融合率的影响及重构胚早期发育的影响，核供体细胞经冷冻保存解冻后直接用于核移植，同新鲜对照细胞相比，对电融合率及早期发育没有显著影响(P＞0.05)。
7.分别用D-山梨醇和D-甘露醇电融合液，研究其对电融合及核移植胚早期发育的影响，其融合率分别为59.22、56.36％，不同电融合液组成对电融合率影响差异不显著(P＞0.05)，但山梨醇融合液融合率略高，且操作较为容易。
8.融合液中加入CB和未加CB重构胚的电融合效率分别为46.22％、56.25％，二者差异显著(P＜0.05)，死卵率差异不显著(P＞0.05)，对核移植胚胎的早期发育没有显著影响(P＞0.05)。