论文部分内容阅读
背景:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性全身性自身免疫病,狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)是SLE最常见及最严重的临床表现之一。临床上糖皮质激素及免疫抑制剂是LN患者常用的治疗药物,但是不良反应较大,有相当一部分难治性LN患者病情持续活动,最终导致终末期肾衰竭。补体系统过度活化是LN病情活动的重要标志。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗SLE及LN患者取得了良好效果,但确切机制尚不清楚。目的:本课题通过探讨C5分子在LN中的致病作用,研究间充质干细胞移植治疗对狼疮性肾炎模型小鼠(B6.MRL/1pr,B6.1pr)C5分子活化的影响,阐明MSCs调控补体C5分子活化的机制。方法:66例SLE患者分为活动期LN(33例),缓解期LN(17例)及非LN组(16例),以年龄性别匹配的40例献血者为健康对照。40例LN(I～V型)患者肾活检标本及9例泌尿系肿瘤患者行肾切除术的肾组织标本。7例行MSCs移植治疗的LN患者。26周龄雌性狼疮小鼠(B6.lpr)随机分为环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)、MSCs、C5a 受体 1 拮抗剂(C5a recepter 1 antagonist,C5aRA)治疗组及空白对照组,每组8只小鼠,同龄雌性C57BL/6小鼠做为正常对照(n=6)。生化检测尿蛋白、血白蛋白及血肌酐水平。ELISA法分别检测C3、C5a、可溶性 C5b-9(Soluble C5b-9,sC5b-9)、H 因子(Factor H,FH)、丛集素(Clusterin,CLU)、干扰素-α(Interferon-α,IFN-α)、抗 dsDNA 抗体及甘露糖结合凝集素(Mannose binding lectin,MBL)水平。对SLE患者进行SLEDAI评分,采用HE、PAS、PASM、Masson染色及透射电子显微镜检查评估肾脏病理学变化,并对肾小球肾炎等病变进行分类评分。免疫组化或免疫荧光检测肾脏C5a、膜攻击复合物(Membrane attack complex,MAC)、C5aR1(CD88)、MBL、IgG、IgM、IgA、C3、C1q 及 P 因子(Factor P/Properdin,FP)的表达。以不同浓度的IFN-α1b体外刺激无血清培养的P4～P10代脐带MSCs,收集0h、12h、24 h、48 h及72 h的培养上清,提取贴壁MSCs的总RNA,real-time PCR检测C3、C3a受体(C3a recepter,C3aR)、C5aR1、B 因子(Factor B,FB)、FH、CD46、CD55、CD59及CLU的基因表达水平,检测MSCs培养上清FH及CLU的水平。通过C3b裂解试验及Zn2+引发的C9多聚化试验分别验证MSCs来源的FH及CLU的功能特性。结果:SLE患者血浆C5a及sC5b-9水平显著高于健康对照,LN组及非LN组SLE患者血浆C5a及sC5b-9水平亦显著高于健康对照,LN患者尿液C5a及sC5b-9水平均显著升高,且活动期LN患者血浆C5a水平显著高于缓解期LN患者(43.93±5.04 vs.28.63±3.20 ng/ml,p<0.05)。血浆 C5a 水平分别与 SLE 患者SLEDAI评分及LN患者尿蛋白定量呈显著正相关,LN患者血浆与尿液sC5b-9水平呈显著正相关。免疫组化结果显示LN患者肾小球C5a、MAC及CD88的表达水平显著高于对照组,且Ⅰ型及Ⅱ型LN患者肾小球C5a、MAC及CD88的表达水平显著低于Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型LN。相关性分析发现,LN患者肾小球内C5a及CD88的表达水平均与肾脏活动性指数呈显著正相关,肾小球内MAC的沉积程度与肾脏的慢性指数及小管间质损害呈显著正相关。与空白对照组狼疮小鼠相比,CTX、MSCs及C5aRA治疗组小鼠尿蛋白均显著减少,CTX及MSCs治疗组小鼠血肌酐水平亦显著降低,MSCs及C5aRA治疗组狼疮小鼠血浆C3水平显著升高,且MSCs治疗组小鼠血浆C5a水平显著降低(50.86±17.07 vs.170.60±47.15 ng/ml,p<0.05)。与空白对照组狼疮小鼠相比,各治疗组小鼠系膜增生性肾小球肾炎明显减轻,MSCs及C5aRA治疗可显著减少狼疮小鼠肾血管周围炎症细胞的浸润。MSCs组小鼠肾小球C5a、MAC及MBL的沉积均显著降低,CTX治疗组小鼠肾小球MAC的沉积显著减少。与空白对照组狼疮小鼠相比,MSCs治疗组小鼠肾小球IgG、IgA、C3、C1q及FP的表达均显著减少,CTX及C5aRA组小鼠肾小球IgG、C3及FP的表达显著下降。MSCs基础状态下表达上述9种补体分子及调节蛋白的mRNA。IFN-α1b体外刺激MSCs可显著上调FH及CLU的表达。MSCs来源的FH体外可以辅助Ⅰ因子(Factor I,FI)裂解C3b分子,MSCs来源的CLU分子体外可以抑制由Zn2+引发的C9多聚体的形成。SLE、LN患者血浆IFN-α水平显著高于健康对照,活动期LN患者血浆FH及CLU 水平显著低于健康对照(369.30±22.92 vs.524.90±36.58 μg/ml,p<0.001;22.23±1.50 vs.26.61±1.17 μg/ml,p<0.05)。MSCs移植治疗可显著上调狼疮小鼠的血浆FH及CLU水平,显著升高LN患者的血浆FH水平(630.90±140.20 vs.481.30±158.70 μg/ml,p<0.05)。结论:补体C5分子的广泛过度活化参与了 LN的发病和进展。MSCs移植显著改善狼疮小鼠的肾小球肾炎,抑制循环及肾脏局部补体C5的过度活化,效应机制包括上调补体调节蛋白FH和CLU的表达及干扰补体经典途径、替代途径及凝集素途径的激活。