背景与目的A型血友病(hemophilia A, HA)是一种由于凝血因了Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因缺陷所致的严重的出血性疾病,是临床上最常见的X连锁隐性遗传病,在男性中的发病率约为1/5000。主要临床表现是自幼反复发生异常出血,出血部位为关节、肌肉、皮肤、粘膜和软组织,上消化道及泌尿系统出血也较常见,重型患者(FⅧ因子活性<1%)可因内脏及颅内出血而危及生命。FⅧ基因的致病突变分散在所有外显子及其侧翼内含子序列上,内含子22倒位是FⅧ基因最常见的突变类型,导致约45～50%重型HA,占所有HA患者的20%；另一常见突变内含子1倒位导致约5%的重型HA；其余有点突变、大片段缺失、小片段缺失、插入等。目前血友病的治疗主要是因子替代治疗,基因治疗和细胞移植治疗是未来的治疗方向。因子替代治疗是目前HA临床治疗中首选方案,但是替代治疗需要定期反复输注FⅧ,花费巨大,8%～25%的患者在治疗过程中产生FⅧ抑制物使治疗无效。血友病被认为是最适合基因治疗的疾病之一,血浆中FⅧ浓度只要达到正常浓度的1%-5%就能起到明显的治疗效果,人FⅧ的表达不局限于某一特定的靶细胞,许多细胞都能产生有生物活性的FⅧ,并能分泌至血液中。基因治疗的目标是将正常的FⅧ基因导入血友病A患者体内,纠正FⅧ基因缺陷,从而使患者体内产生具有正常功能的人FⅧ蛋白。目前仅有极少数研究报道血友病基因治疗的临床Ⅰ期试验成功,现有基因治疗失败最主要的原因是宿主免疫反应使外源野生型基因表达水平逐渐减低甚至消失,另外载体插入突变可能使基因治疗患者发生肿瘤。细胞移植治疗是指利用健康的细胞来修复或取代损伤的组织,但移植细胞来源、免疫排斥等是很难解决的问题。动物实验是血友病机制、治疗研究中不可缺少的环节。自然中存在的血友病模型有犬模型,人工基因剔除血友病动物模型有小鼠、羊、灵长类等种类。人类与动物在生理、生化、解剖结构上有着巨大差异,种属间的细胞转染率、基因表达、蛋白修饰加工和免疫反应均存在差别,在动物模型上筛选有效的药物或治疗方法在人体上可能无效,动物研究尚不能完全预测临床结果,应当通过其它种类疾病模型的实验方案来验证动物实验的有效性。2006年诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技术诞生了。由体细胞重编程得到的iPSCs与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)有相同的特征：具有自我更新和分化为身体各种组织与器官的潜能,都属于多能性干细胞。iPSCs不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等诸多方面的限制。利用iPSCs诱导技术可以将患者体细胞重编程成为患者特异性iPSCs,作为疾病的细胞模型来开展发病机制、药物筛选、毒理等研究工作。患者来源的iPSCs能够产生病人特异性的供体细胞用于细胞移植和组织替代治疗,没有伦理及免疫排斥等问题,从而最终实现个体化自体细胞移植治疗,这是现有细胞移植治疗或基因治疗所不能比拟的优势。2009年,Xu D等将鼠尾尖部皮肤的成纤维细胞重编程成iPSCs,然后定向分化为内皮祖细胞和内皮细胞。再将这些分化出来的内皮祖细胞或内皮细胞直接注射到用射线处理过的血友病A模型鼠的肝脏,通过尾部出血分析发现,未处理组的血友病A模型鼠几个小时全部死亡,处理组的血友病A模型鼠存活在3个月以上,小鼠血浆中凝血因子Ⅷ的活性较对照组升高8%-12%,出血症状得到了很大的改善。这是首个关于iPSCs治疗血友病的研究,展现了iPSCs在血友病治疗上的应用前景,为HA的研究提供了新的契机。迄今为止,人血友病iPSCs的相关研究还是空白,建立不同人FⅧ基因突变类型的iPSCs细胞库可以为深入研究HA疾病提供一个新的平台,为今后的临床应用提供最基本条件。本研究以HA病人中最常见的FⅧ基因突变类型ⅣS22倒位为研究对象,建立了15株HAiPSCs细胞系,对其中两株进行了全面的鉴定；同时将HAiPSCs定向分化为肝细胞,并在此基础上建立了HA的细胞疾病模型,为今后HA的疾病机制研究、药物筛选及细胞移植治疗奠定研究基础。方法1.A型血友病人非整合iPSCs的建立与鉴定收集A型血友病重型病人的尿液标本,分离及培养尿细胞。利用oriP/EBNA1附加体(episome)载体过表达人OCT4、SOX2、KLF4三个转录因子以及SV40LT基因,将病人尿细胞重编程为iPSCs,同时利用小分子核糖核酸(microRNA, miRNA)302-367簇提高重编程效率。在诱导过程中,采用无血清、无滋养层细胞的方式进行诱导,避免诱导过程中的动物成分的污染给将来的应用带来潜在的危害。在获得HA iPSCs克隆后,需要做多方面的综合鉴定判断该克隆是否真正获得了多能性状态。通过免疫荧光及流式细胞术鉴定人胚胎干细胞标志物的表达。RT-PCR检测内源多能性基因的表达及外源基因是否沉默。PCR检测外源多能性基因或外源载体片段是否整合进入iPS细胞基因组中。通过重硫酸盐测序分析,比较多能性基因(NANOG及OCT4)启动子区甲基化程度的改变。应用长距离PCR对HA尿细胞和HA iPSCs的基因组DNA进行FⅧ基因内含子22倒位的检测,确认HA的突变类型。核型分析鉴定HA iPSCs的核型是否正常。微卫星鉴定确认HAiPSCs的亲本来源及排除实验室ESCs的污染。拟胚体实验验证HAiPSCs体外分化潜能。畸胎瘤实验验证HA iPSCs体内分化潜能。2.A型血友病人iPSCs体外定向肝分化将HAiPSCs定向分化为肝细胞分为4个阶段：确定内胚层(definitive endoderm,DE)定向,肝前体定向,肝前体扩增和肝细胞成熟。在单层和无血清的培养条件下,分4个阶段序贯加入激活素A(Activin A);成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor4, FGF4)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins2, BMP2);肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)和角质化细胞生长因子(kerationcyte growth factor, KGF);制瘤素(oncostatin M, OSM)和糖皮质激素(glucoconicoid),促使HA iPSCs诱导分化为成熟的肝细胞。应用免疫荧光鉴定肝细胞分化各个阶段的特异性蛋白表达,PAS糖原染色分析鉴定HA iPSCs来源的肝细胞是否具备合成和储存糖原的能力。3.A型血友病细胞模型的疾病表型鉴定在HA iPSCs分化的肝细胞的基础上,从转录水平、蛋白水平、功能水平观察血友病A疾病表型。应用荧光定量PCR检测分化肝细胞FⅧ基因mRNA的表达。免疫荧光鉴定分化肝细胞FⅧ蛋白的表达。FⅧ活性测定鉴定分化肝细胞表达的FⅧ蛋白的凝血功能。结果1.A型血友病人非整合iPSCs的建立与鉴定共建立了15株HA iPSCs细胞系,对其中两株进行了全面鉴定。HA iPSCs具有典型的ESCs克隆的形态：克隆致密、细胞核大、高核质比。HA iPSCs呈现碱性磷酸酶阳性,表达人胚胎干细胞核抗原NANOG、OCT4及人胚胎干细胞特异的表面标记SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。其外源基因表达沉默,内源多能性基因表达,基因组DNA无外源基因及载体序列的整合。与HA尿细胞相比,HA iPSCs的NANOG和OCT4启动子区发生了显著的去甲基化。HA iPSCs FⅧ基因突变类型为内含子22倒位。HA iPSCs核型正常,其来源于HA尿细胞并且无ESCs的污染。拟胚体和畸胎瘤实验证明,HA iPSCs具有分化为三个胚层的能力。2.A型血友病人iPSCs体外定向肝分化HA iPSCs诱导分化的成熟肝细胞呈现类似于肝上皮细胞的多边形形态,细胞核清晰,胞质内颗粒丰富。免疫荧光结果显示HA iPSCs在肝分化过程中不同阶段表达相应的分子标志：确定内胚层阶段表达SOX17和FOXA2,肝细胞前体阶段表达HNF4a和AFP,肝细胞成熟阶段表达A1AT和ALB。分化成熟的肝细胞PAS糖原染色阳性,反映其具备合成和储存糖原的能力。3.基于iPS技术的A型血友病细胞疾病模型的建立与无FⅧ缺陷的正常对照组相比,FⅧ基因内含子22倒位的HA iPSCs体外定向分化得到的肝细胞不能正常转录FⅧ基因nRNA,不能表达正常的FⅧ蛋白。HA iPSCs分化肝细胞的培养上清及细胞裂解液中FⅧ活性远远低于正常iPSCs及ESCs诱导的肝细胞。上述结果表明,基于iPS技术的A型血友病细胞疾病模型成功建立。结论1.采用episome系统,以无血清、无滋养层细胞的诱导方式能将FⅧ基因ⅣS22倒位的HA病人的尿细胞重编程为iPS细胞,从而建立了非病毒的、无外源DNA整合的、安全的、HA病人特异性的iPS细胞系。2.在无血清单层培养的条件下,模拟体内肝脏的发育过程,不同时间点添加不同生长因子组合,能将HA iPSCs定向分化为肝细胞。这为解决HA肝细胞来源提供了新途径,为肝细胞药物筛选和肝细胞移植治疗提供了新的种子细胞。3.在HA iPSCs定向分化的肝细胞水平上,能够观察到HA的疾病表型即FⅧ凝血功能缺陷,成功建立了基于iPS技术的HA细胞疾病模型,从而为深入研究HA的疾病机制、开发新型安全治疗药物以及寻找更优化的治疗方案提供了一个新的平台。