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激光光镊拉曼光谱技术是将光镊技术与激光显微拉曼技术相结合的技术,是利用高数值孔径物镜将激光光束高度聚焦在三维空间上实现对微粒的囚禁,并获取微粒拉曼光谱信息的一种新技术。激光光镊拉曼光谱技术主要应用于单个细胞、微观粒子、生物大分子的研究,由于其具有简单、反应快、非入侵、无损伤、可重复和灵敏度高等优点,已经成为研究单细胞分子结构最热门的工具。 血糖是指血液中的葡萄糖,是人体生命活动所需能量的来源。低血糖会产生记忆力衰退、反应迟钝、晕迷等症状;高血糖则引起视网膜、心肌、神经组织微血管的病变,维持体内血糖浓度正常非常重要。人体各个组织细胞都要从血液中获取葡萄糖,尤其是红细胞,成熟的红细胞没有线粒体和细胞核,其自身生存和代谢所需的能量来源于血液中的葡萄糖。因此研究血糖含量、红细胞吸收葡萄糖的方式对维持血糖平衡、血液的冻干保存具有重要意义。 硝酸甘油作为目前防治心绞痛的特效常用药品已有百年历史,它起效快,作用时间短,能够迅速缓解心绞痛,但其在体内的代谢机理仍然具有争议。硝酸甘油在机体内分解生成亚硝酸盐早有报道,但一般认为它是无活性的代谢产物,由具有血管调节活性的一氧化氮氧化(NO)产生。一氧化氮作用于平滑肌细胞,使平滑肌松弛,引起血管扩张,血压下降。硝酸甘油体内代谢涉及多种代谢酶活性、内源性活性物质水平以及受体活性变化,其代谢途径尚未明了,研究硝酸甘油的代谢机理具有重要意义。 本文运用激光光镊拉曼系统进行无创血糖含量检测、分析探索红细胞吸收葡萄糖的方式。同时应用激光光镊拉曼技术对裸鼠耳朵动脉血液进行无创的光谱分析,获取注射硝酸甘油后血液的光谱,连续观察注射硝酸甘油后体内血液成份的变化情况及其药效时间,隔半个小时注射一次硝酸甘油,收集拉曼光谱、分析血管扩张程度探讨硝酸甘油的耐药性。 本文第一章首先介绍了拉曼光谱产生的背景、基本原理和两个重要参数:拉曼位移和拉曼强度;其次介绍了拉曼光谱的一些主要特点,如拉曼散射强度与样品呈线性关系,拉曼位移反映分子的振动-转动的信息又与激光的激发波长无关,样品无需制备无需接触且无创伤,适合用于研究水溶液的生物样品等特点;再次文章介绍了拉曼光谱仪的组成成份:光源,外光路系统,色散系统和信号探测处理系统;最后介绍了其他拉曼光谱法,如共振拉曼光谱、表面增强拉曼散射、傅立叶变换近红外拉曼光谱。 第二章主要介绍激光光镊拉曼系统。首先介绍光镊的产生背景、光镊的基本原理、光镊的应用;其次介绍了激光光镊拉曼光谱系统装置,包括光镊系统和拉曼系统,主要部件有:半导体激光器、光谱仪、倒置显微镜、光电耦合探测器CCD和一些光学器件;最后介绍了拉曼光谱信号处理的方法:基线校正和归一化法。 第三章利用激光光镊拉曼系统无创的检测血糖含量、探究红细胞吸收血糖的方式,结果显示血液的拉曼光谱与红细胞的拉曼光谱基本相同,主要由752、1001、1214、1450、1549、1618cm-1血红蛋白峰和1125cm-1血糖峰组成,血浆的拉曼光谱含有微弱的血红蛋白峰,是因为使用肝素钠抗凝剂使血液没有凝固而保留的凝血因子和纤维蛋白,血清在是血液凝块后稀释出的淡黄色液体,在凝结过程中消耗了凝血因子和纤维蛋白,因此血清不含有纤维蛋白,血浆中含有微量的纤维蛋白。红细胞的1125cm-1血糖峰明显比血浆的高,蒽铜比色法显示红细胞内血糖含量是血浆的1.5倍左右。使用不同浓度的葡萄糖溶液处理血液后,发现随着葡萄糖浓度逐渐增加,葡萄糖借助膜结构中某些特殊膜蛋白的帮助迅速进入红细胞使血糖含量增加,红细胞吸收葡萄糖不仅通过易化扩散的方式,还存在主动运输的方式。 第四章利用拉曼光谱对注射硝酸甘油后的活体裸鼠体内动脉血液进行实时连续无损的分析,每隔10秒获取一个动脉血管内血液的拉曼光谱,光谱分析表明:活体血液的拉曼光谱主要体现在以下几个位置:1548,1618,1654cm-1(与蛋白质相关),1125cm-1(与血糖相关)。通过分析部分特征峰发现注射硝酸甘油后在280-730秒内光谱强度下降,表明体内血液浓度变稀释,这可能是由于血管扩张引起的。峰强度在注射硝酸甘油前后变化:1548cm-1峰强度从1965.42到1273.61,下降35.2%,1125cm-1峰强度从411.59到223.79,下降46.63%,说明血液中蛋白质、血糖的含量有不同程度的减少,即裸鼠体内血液中的血红蛋白质发生变性、血糖含量明显降低。为了研究硝酸甘油的耐受性,第一次注射硝酸甘油后半个小时再注射等量的硝酸甘油,结果显示:第二次注射硝酸甘油与第一次相比,血红蛋白特征峰需要消耗更多时间才开始下降,并且下降程度不如第一次,说明裸鼠在连续使用硝酸甘油后产生了耐药性现象,其原因可能是因为硝酸甘油转化为NO需要消耗疏基(SH)和半胱氨酸,在第二次注射硝酸甘油后,半胱氨酸不能及时补充,因此NO生成减少,硝酸甘油药效减弱。