砷是一种明确的环境污染物,在土壤,水和空气颗粒中普遍存在。目前流行病学研究已经明确发现,砷的暴露与肺癌,皮肤癌,膀胱癌,肾癌和肝癌的发展密切相关。砷的暴露形式主要两种,亚砷酸盐(As3+)和砷酸盐(As2+),而增加癌症发病率的主要是亚砷酸盐,而不是砷酸盐,原因可能是由于细胞能更快的吸收亚砷酸盐。目前的研究已经发现亚砷酸盐可以干扰多种细胞过程,其中包括细胞的氧化还原状态和信号转导通路等,最近又有证据表明,亚砷酸盐还可以通过调控染色质机制促进细胞转化,但其具体机制仍不明确。肿瘤干细胞(TSCs)特性获得参与了多种疾病,特别与恶性肿瘤的发生和发展有关。近年,TSCs特性获得与肿瘤细胞恶性程度和转移关系及其分子机制的研究已成为热点,但对于TSCs特性获得在环境致癌物所致细胞恶性转化及致癌过程中的作用和分子机制的研究报道甚少。因此深入研究砷化物所致细胞恶性转化和表遗传调控的具体信号通路,特别是研究调控砷化物诱导TSCs特性获得在恶性转化过程中的作用及其分子机制对于寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施具有重要理论意义和实用价值。为此,本研究在课题组前期构建的NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞恶性转化模型基础上,应用多种分子生物学方法探讨表观遗传学调控对let-7c与Ras/NF-κB的影响,并深入研究NaAsO2诱导HaCaT细胞TSCs特性获得和恶性转化过程中的相互作用及其分子过程,以揭示NaAsO2所致细胞恶性转化的部分分子机制,从而为进一步理解砷化物致癌的分子机制和寻找砷中毒的生物学标志及防治措施提供一定的科学依据。方法一、亚砷酸钠慢性处理所致HaCaT细胞TSCs特性获得分别用0.0或1.0 μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞0、10、20和30代(约15 w),获得不同代数的同代对照HaCaT细胞(HaCaT-PC)和不同恶性程度的HaCaT细胞(HaCaT-As)后,用qRT-PCR检测HaCaT细胞干细胞表面抗原CD34和K5 mRNA水平;用悬浮集落形成试验检测细胞TSCs特性,以观察NaAsO2慢性处理对HaCaT细胞TSCs特性获得的影响。二、亚砷酸钠对HaCaT细胞Ras/NF-κB的影响分别用0.0或1.0μMNaAsO2慢性处理HaCaT细胞0、10、20和30代;或用 1.0 μM NaAsO2 急性处理 HaCaT 细胞 0、3、6、12 和 24 h 后,用 Western blot方法检测细胞Ras、RelA和p-RelA水平,以观察NaAsO2对HaCaT细胞Ras/NF-κB的影响。三、亚砷酸钠对HaCaT细胞let-7c水平的影响分别用0.0或1.0 μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞0、10、20和30代,获得同代对照HaCaT-PC细胞和不同恶性程度HaCaT-As细胞;或用1.0 μM NaAsO2急性处理HaCaT细胞0、6、12和24 h后,用qRT-PCR检测细胞let-7c水平,以观察NaAsO2对HaCaT细胞let-7c水平的影响。四、亚砷酸钠通过甲基化调控影响HaCaT细胞let-7c水平和Ras/NF-κB 激活用软件预测let-7c启动子区的CpG岛区;分别用0.0或2.5μM 5-AZA(甲基转移酶抑制剂)预处理HaCaT细胞24 h后,再分别用0.0或1.0 μM NaAsO2处理HaCaT细胞24 h,用qRT-PCR检测细胞let-7c水平;用Western blot方法检测细胞 Ras、RelA 和 p-RelA水平;用 0.0 或 1.0 μM NaAs02 慢性处理 HaCaT细胞30代,或用0.0或1.0 NaAsO2急性处理HaCaT细胞24 h后,进行MSP实验检测HaCaT细胞let-7c启动子区DNA甲基化水平,以观察NaAsO2通过甲基化调控对HaCaT细胞let-7c水平和Ras/NF-κB激活的影响。五、亚砷酸钠对HaCaT细胞EZH2和H3K27me3水平的影响分别用0.0或1.0 μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞0、10、20和30代;或分别用0.0或1.0 NaAsO2急性处理HaCaT细胞0、6、12和24 h后,用Western blot检测细胞EZH2和H3K27me3水平,以观察NaAsO2对HaCaT细胞EZH2和H3K27me3 水平的影响。六、EZH2/H3K27me3在亚砷酸钠所致let-7c水平降低中的作用分别用20.0 nM EZH2-siRNA或con-siRNA转染预处理HaCaT细胞12 h后,再用0.0或1.0 μMNaAsO2急性处理HaCaT细胞24 h,用Western blot方法检测细胞EZH2和H3K27me3水平;用qRT-PCR检测细胞let-7c水平;分别用0.0或1.0 NaAsO2急性处理HaCaT细胞24 h后,用ChIP实验检测细胞EZH2和H3K27me3分别与let-7c启动子区结合程度,以观察EZH2/H3K27me3在NaAsO2所致let-7c 水平降低中的作用。七、上调let-7c对亚砷酸钠所致HaCaT细胞Ras/NF-κB激活的影响分别用50.0 nM con-mimic或let-7c-mimic转染处理HaCaT细胞6 h后,再用0.0或1.0 NaAs02处理HaCaT细胞24 h,用Western blot方法检测细胞Ras、RelA 和 p-RelA水平,以观察 let-7c 对 NaAsO2所致 HaCaT 细胞 Ras/NF-κB激活的作用。八、上调let-7c对亚砷酸钠所致恶性转化HaCaT细胞TSCs特性获得和恶性程度及致瘤性的影响分别用 50.0 nM con-mimic 或 let-7c-mimic 转染处理由 1.0 μM NaAsO2 慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞,用qRT-PCR检测HaCaT细胞干细胞表面抗原CD34和K5 mRNA水平;用悬浮集落形成试验检测细胞TSCs特性;用软琼脂集落形成试验检测细胞恶性程度;裸鼠成瘤实验检测细胞致瘤性,以观察let-7c对NaAsO2所致恶性转化HaCaT细胞TSCs特性获得和恶性程度及致瘤性的影响。结果一、亚砷酸钠慢性处理所致HaCaT细胞TSCs特性获得结果发现1.0 μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞30代后,随着代数的增加,细胞中干细胞表面抗原CD34和K5 mRNA水平逐渐升高;1.0μM NaAsO2慢性处理10代HaCaT细胞开始形成悬浮细胞集落,20代时悬浮细胞集落明显增多,且随NaAsO2处理代数延长,上述改变越明显。说明NaAsO2慢性处理可诱导HaCaT细胞TSCs特性获得。二、亚砷酸钠对HaCaT细胞Ras/NF-κB的影响结果发现1.0 μM NaAsO2慢性和急性处理HaCaT细胞,随着代数或时间的增加,均引起细胞中k-ras和p-RelA水平显著升高,且存在一定时间-效应关系。说明NaAs02慢性处理HaCaT细胞可激活Ras/NF-κB。三、亚砷酸钠对HaCaT细胞let-7c水平的影响结果发现1.0 μM NaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞let-7c水平显著低于同代对照HaCaT细胞;1.0 μM NaAsO2慢性和急性处理,随着代数或时间的增加,均引起细胞中let-7c水平显著下降。说明NaAsO2处理可使HaCaT细胞let-7c水平降低,并具有一定时间-效应关系。四、亚砷酸钠通过甲基化调控影响HaCaT细胞let-7c水平和Ras/NF-κB 激活结果发现let-7c的启动子区存在可被甲基化的CpG岛区;1.0 μM NaAsO2处理的HaCaT细胞let-7c水平明显下降,k-ras和p-RelA水平明显上升,而同时用2.5 μM 5-AZA和1.0μM NaAsO2处理的HaCaT细胞let-7c水平重新回升,k-ras和p-RelA水平重新回降;恶性转化HaCaT细胞let-7c启动子区的DNA甲基化程度和DNA非甲基化程度与传代对照细胞均无明显差异,1.0 NaAsO2急性处理HaCaT细胞DNA甲基化程度略低于正常细胞,DNA非甲基化程度与正常细胞无明显差异。说明NaAsO2是通过甲基化作用促使HaCaT细胞let-7c水平下降,进而激活Ras/NF-KB,但let-7c下降的原因并不是由简单影响DNA甲基化水平所致。五、亚砷酸钠对HaCaT细胞EZH2和H3K27me3水平的影响结果发现1.0 μM NaAsO2慢性和急性处理HaCaT细胞,随着代数或时间的增加,均引起细胞中EZH2和H3K27me3水平显著升高,且存在一定时间-效应关系。说明NaAsO2处理可引起HaCaT细胞EZH2水平和H3K27me3水平升高。六、EZH2/H3K27me3在亚砷酸钠所致let-7c水平降低中的作用结果发现关闭EZH2可明显阻滞1.0 NaAs02所致HaCaT细胞H3K27me3水平升高和let-7c水平降低;NaAsO2可增加HaCaT细胞let-7c启动子区与EZH2和H3K27me3的结合程度。说明NaAsO2使HaCaT细胞中let-7c启动子区EZH2/H3K27me3富集,进而沉默let-7c的表达。七、上调let-7c对亚砷酸钠所致HaCaT细胞Ras/NF-κB激活的影响结果发现转染let-7c-mimic的HaCaT细胞k-ras和p-RelA水平相对于单纯1.0 NaAsO2处理的HaCaT细胞明显下降,上调let-7c水平可以阻滞NaAsO2所致HaCaT细胞k-ras和p-RelA水平升高。说明let-7c在NaAs02所致HaCaT细胞Ras/NF-κB激活中发挥重要作用。八、上调let-7c对亚砷酸钠所致恶性转化HaCaT细胞TSCs特性获得和恶性程度及致瘤性的影响结果发现转染let-7c-mimic的1.0 NaAsO2慢性处理30代所致恶性转化HaCaT细胞CD34和K5 mRNA水平显著低于转染con-mimic的恶性转化HaCaT细胞;细胞悬浮细胞集落形成数显著降低;软琼脂集落克隆形成数显著减少;且在裸鼠皮下不能形成肿瘤,上调let-7c可抑制NaAsO2所致恶性转化HaCaT细胞TSCs特性获得和恶性程度及致瘤性。说明let-7c在NaAs02所致HaCaT细胞TSCs特性获得和恶性程度及致瘤性中发挥重要作用。结论1、NaAsO2慢性处理可引起HaCaT细胞TSCs特性获得,细胞发生恶性转化且具有致瘤性。2、NaAs02所致HaCaT细胞let-7c水平下降。3、NaAsO2处理HaCaT细胞能够通过EZH2介导的H3K27me3途径沉默let-7c,进而激活 Ras/NF-κB。4、表遗传沉默let-7c激活Ras/NF-κB在NaAsO2所致HaCaT细胞TSCs特性获得和细胞恶性转化及致瘤性中具有重要作用。总之,本研究结果提示NaAsO2通过EZH2介导的H3K27me3途径沉默let-7c,激活Ras/NF-κB,从而引起HaCaT细胞获得TSCs特性,最终导致细胞发生恶性转化和致瘤性。本研究结果说明表遗传沉默let-7c激活Ras/NF-κB在NaAsO2所致HaCaT细胞TSCs特性获得和细胞恶性转化及致瘤性中具有重要作用。