研究背景:　　 口腔黏膜是机体黏膜免疫体系的重要组成部分之一。作为呼吸道、消化道黏膜的共同始端,口腔黏膜是机体免疫防御的第一道防线。外伤、颌面部炎症、肿瘤等容易导致口腔黏膜的缺损。口腔黏膜移植是修复大面积口腔黏膜缺损有效的方法之一。但有关口腔黏膜移植的研究罕见报道,分析因为主要由以下几点:口腔黏膜组织薄弱且张力大,原位缝合困难；容易被口腔微生物感染；往往涉及复合组织移植,操作难度大等。现有研究多以裸鼠作为口腔黏膜移植的受体,但免疫力存在缺陷的裸鼠不能反映免疫力正常正常动物的真实病理特征及过程；部分牙周病治疗采用自体牙龈冠向移植来修复附着丧失或牙龈萎缩,该方法属于同源移植,其病理过程通常不涉及免疫排斥。缺乏合适的动物模型已经成为口腔黏膜移植相关研究的主要瓶颈。因此,有必要建立一个适用于进行口腔黏膜移植免疫病理学研究的动物模型。　　 现有研究认为,组织移植与器官移植在免疫排斥的表现、机制及组织病理学特点等方面均有明显不同,此外组织移植的免疫病理学特征也因部位不同而差别显著。因此,其它器官或组织移植的研究方法、研究结果只能被参考而不能直接用于口腔黏膜移植。作为组织移植的一种,口腔黏膜移植的相关研究严重滞后于其它器官或组织移植。主要反映在两方面:其一,迄今口腔黏膜移植基本的病理学特征、病理分级标准与分期情况等尚未完全明了；其二,口腔黏膜移植后的免疫学特征及机制研究尚未见报道。移植免疫本质上也是一种炎症反应,移植后浸润细胞及分泌细胞因子的种类、数量是决定机体或组织局部移植炎症反应是否发生、发生强度以及有何特点的关键因素。细胞与细胞因子间的相互作用还是移植炎症反应主要的调控因素。采用常规方法很难全面了解过程复杂、参与成分多样的移植炎症反应特征,因此如何高效全面地进行上述免疫学分析是另外一个影响口腔黏膜移植研究的难题和瓶颈。生物芯片技术已经成为高通量分析生物系统性能最重要的平台之一。目前,该技术已被广泛用于包括唾液诊断学、口腔微生物的致病基因筛选、口腔鳞癌标记物与相关基因筛选、口腔扁平苔藓相关基因筛选等口腔疾病的多个研究领域。第二代功能基因组芯片,又称PCR芯片,可根据研究目的将百余个功能相关基因(如炎症相关基因组、通路相关基因组等)集合在同一张芯片上,在一次反应中完成所有基因的荧光定量PCR检测。与传统基因芯片相比,其的优点体现在针对性强、可以直接使用无需验证、准确率高等方面。PCR芯片的特有优势将为全面分析口腔黏膜炎症的免疫特征及机制提供可能。　　 第一章大鼠口腔黏膜异种异体移植模型的建立与观察　　 1.研究目的:　　 以建立的口腔黏膜移植模型为研究工具,明确口腔黏膜移植的主要病理学特征并以此为基础提出口腔黏膜移植的病理学分级标准,据此标准对口腔黏膜移植反应进行病理分级。　　 2.研究方法:　　 (1)实验动物及分组　　 将200只Wistar大鼠按照按照处理方式不同分为以下三组:　　 移植组(Xenograft,X组):将Balb/C小鼠的舌组织移植到Wistar大鼠左侧颊黏膜下,其右侧颊黏膜不做处理(n=80)；　　 创伤组(Trauma,T组):对Wistar大鼠左侧颊黏膜进行与X组相同的创伤及缝合但不移植组织,其右侧颊黏膜不做处理(n=80)；　　 正常对照组(Normal,N组):双侧颊黏膜均不做任何处理(n=40)。　　 (2)取材时点:　　 在术后1天(D1)、D3、D7、D10、D15、D21、D30、D48、D72及D90共10个时点处死动物并取材(D1组只用于组织学观察)。每时点随机选取X组6只、T组6只,N组4只。　　 (3)大体观察与测量　　 观察指标包括:大鼠48天生存率(Survival rate,SR=存活大鼠数目/参与实验大鼠总数)；体重变化百分比(Percent body weight changes,PBW=术后观察当日体重/手术前初始体重×100％)；颊黏膜的肿胀和渗出情况；淋巴结指数(Indexof lymph nodes,ILN=左侧3个最大淋巴结直径之和一右侧3个最大淋巴结直径之和,取绝对值)；脾脏/体重比值(Spleen-to-body weight ratios,SBR=脾脏重量/体重×100％)。　　 (4)外周血检测　　 检测指标包括血常规和血清免疫五项(IgG、IgA、IgM、C3、C4)。　　 (5)组织病理学观察　　 取下整个颊黏膜,按组织病理学常规方法固定、包埋、切片、HE染色,普通光镜下观察分析；以病损组织的中性粒细胞的浸润程度、异种移植物损伤与修复的情况为基础进行病理分级,分级标准如下:　　 G1:无明显组织结构破坏区及炎症细胞浸润；　　 G1:坏死、脓肿区大部分由纤维或胶原组织包裹或替代,伴少量组织细胞、浆细胞、淋巴细胞等慢性炎症细胞浸润,罕见中性粒细胞；　　 G2:坏死区被较多增生的纤维组织环绕并逐渐被吸收,面积减少。可见较多的巨噬细胞、组织细胞、浆细胞、淋巴细胞和少量中性粒细胞、脓细胞浸润；　　 G3:少量或部分移植物出现坏死,伴中等量的中性粒细胞浸润；　　 G4:部分或全部移植物凝固性坏死,伴密集的中性粒细胞或脓细胞浸润。　　 3.结果:　　 (1)大体观察:　　 生存率:X组48天SR为87.50％,与T组和N组无显著差别；　　 体重:X组和T组术后体重均显著下降,X组需要10天恢复初始体重而T组只需6天；　　 口腔局部:X组术后3天口腔黏膜开始肿胀,7-15天肿胀、溢脓明显,以后逐渐减轻,30天左右基本消退；　　 淋巴结肿大:X组术后7-15天SMLN显著肿大；X-D7组的ILN明显高于N-D7组,X-D10组显著高于T-D10组及N-D10组；　　 脾脏肿大:各组的SBR在所有检测时点均无明显差别。　　 (2)外周血检测结果:　　 各实验组的的血常规和血清免疫五项在所有检测时点均无明显差别。　　 (3)组织学观察及病理分级情况　　 免疫病理特征:移植早期以移植物的坏死伴中性粒细胞突出浸润为特点,以天然免疫为主导；后期以坏死物的吸收、组织的修复伴巨噬细胞及组织细胞、浆细胞、T细胞等炎症细胞的浸润为特征,是天然免疫与适应性免疫共同作用的结果。　　 按照本研究提出的分级标准,口腔黏膜异种异体移植排斥反应90天的观察期可被分为如表1.2所示的0-4级,按出现顺序概述如下:术后一周内主要以3级病理表现为主,D1组、D3组91.67％(11/12)的大鼠属于病理3级；术后7-15天,病理表现主要为炎症反应最严重的4级,D7组、D10及D15组83.33％(15/18)大鼠属于病理4级；术后21-30天以2级病理表现为主,D21组、D30组91.67％(11/12)的大鼠属于病理4级；30天后到72天左右,1级病理表现明显,D48组6只大鼠均属于病理1级；移植术后72-90天,病理表现为1级向0级过渡,D72组、D90组83.33％(10/12)的大鼠属于病理0级。　　 4.结论:　　 本研究初步了建立口腔黏膜异种异体移植模型,为深入开展口腔黏膜移植免疫学研究提供了良好的研究工具；首次明确了口腔黏膜异种异体移植主要的病理学特征,并以此为基础提出病理学分级标准；据此标准对90天观察期的口腔黏膜移植反应进行了相应的病理分级。　　 第二章中性粒细胞浸润是大鼠口腔黏膜移植的早期事件　　 1.研究目的:　　 比较口腔黏膜移植早、晚期髓过氧化物酶(MPO)相对含量,以定量分析方式明确中性粒细胞的浸润规律；进行Fk506干预实验以明确中性粒细胞在移植早期所起的作用。　　 2.研究方法:　　 (1)建模及分组:　　 按照第一章方法建立移植组(X,n=24)、创伤组(T,n=24)和正常组(N,n=16)动物模型。其中X组、T组各12只,N组8只大鼠接受FK506处理(术前3天,2mg/kg/d加术后7天0.5 mg/kg/d口服灌胃),分别命名为FX组、FT组及FN组。　　 (2)取材及样本制备　　 分别于术后D7、D30处死X组、T组及N组大鼠,每时点取X组6只、T组6只,N组4只。去皮后取下整个颊黏膜和颌下淋巴结,液氮冻存备用。　　 术后D7处死FX组、FT组及FN组大鼠,其中FX组12只、T组12只,N组8只。半数取下其整个颊部组织(从皮肤侧到黏膜侧),置于10％的中性福尔马林中固定；半数去皮后取下整个颊黏膜及颌下淋巴结,液氮冻存备用。　　 (3)ELISA方法检测各组D7、D30口腔黏膜和/或SMLN中MPO含量。　　 (4)其余观测指标包括:口腔黏膜肿胀、渗出情况及颌下淋巴结肿大情况等。　　 3.结果:　　 (1)各组D7、D30口腔黏膜MPO表达情况:　　 X-D7组MPO水平显著高于T-D7组、N-D7组及X-D30组(三组间P<0.001)；X-D30组的MPO水平显著高于N-D30组(P=0.042)。　　 经Fk506处理后,病损组织MPO水平:FX-D7组较X-D7组显著下降(p=0.005),仍高于FT-D7组及FN-D7组(P值分别为0.001和0.019)。　　 淋巴结MPO水平:Fk506处理前、后各组颌下淋巴结处MPO的表达无显著变化(P值均>0.05)。　　 (2)Fk506处理前后各组大体及组织学情况　　 另外还发现,经FK506处理的动物颊黏膜的肿胀、渗出及颌下淋巴结肿大明显缓解；中性粒细胞的浸润及移植物的破坏程度均明显减轻。　　 4.结论:　　 以中性粒细胞为代表的天然免疫细胞在口腔黏膜移植早期发挥重要作用,中性粒细胞浸润是口腔黏膜移植的早期事件,加剧了移植排斥反应。　　 第三章口腔黏膜移植中炎症性细胞因子趋化因子表达谱研究　　 1.研究目的:　　 应用大鼠炎症性细胞因子趋化因子PCR芯片检测口腔黏膜移植早、晚期多种炎性细胞因子、趋化因子的表达情况,以筛选出与移植相关的差异基因并探讨差异基因的生物学功能,以揭示口腔黏膜移植主要的免疫学特点和机制,为有效控制口腔黏膜移植排斥提供研究基础。　　 2.研究方法:　　 (1)建模及分组　　 按照第一章方法建立移植组(X,n=6)、创伤组(T,n=6)和正常组(N,n=3)动物模型。　　 (2)取材及样本制备　　 分别于术后D7、D30处死X组及T组大鼠,每组3只；N组3只大鼠在购买当天即处死。去皮后取下整个颊黏膜,液氮冻存备用。　　 (3)芯片检测用样本的制备　　 Trizol法提取组织总RNA,去除DNA并纯化,质检合格后逆转录成cDNA。　　 (4)PCR芯片检测与结果分析　　 完成大鼠炎症性细胞因子趋化因子PCR芯片(美国SABiosciences公司)的荧光定量PCR反应。采用ΔΔCt方法计算靶基因的相对含量(β-actin为内参)及倍数变化值；差异基因的筛选标准:从计算结果中筛选出该基因在X组中表达水平比N组上调2倍或下调2倍以上的基因,并除去T组中同样也升高的基因。　　 3.结果:　　 X-D7组:17种基因表达上调,其中趋化因子家族10个(CCL12、CCL17、CCL22、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CXL1、CXCL2、XCR1),与中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞的募集有关；细胞因子家族7个(IL-10、IL-11、IL—1Rb、IL-3、IL-4、Lta、Spp1),分别属于Th1型、Th2型细胞因子及集落刺激因子家族,涉及调控感染、炎症及移植免疫反应等。　　 X-D30组:仅有CCL24、IL-1f6表达上调,前者主要与静止的T细胞、嗜酸性粒细胞的募集有关；后者是IL-1家族新发现的成员,介导炎症信号通路NF-kappaB和MAPKsIL-1的活化。　　 4.结论:　　 差异表达的趋化因子基因与中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞的募集有关；Th1细胞因子型、Th2细胞因子及其它炎症细胞因子参与了口腔黏膜移植免疫。因此推测口腔黏膜移植后的炎症反应是天然免疫与适应性免疫、促炎因素与抑炎因素协同作用的免疫病理过程,上述作用的失衡可能是导致移植物损害加剧的主要因为。　　 第四章 CINC-1-CXCR2轴在大鼠口腔黏膜移植中的作用研究　　 1.研究目的:　　 分别从mRNA及蛋白水平比较口腔黏膜移植早、晚期中性粒细胞主要的趋化因子CINC-1-CXCR2轴表达的变化,以探明其表达规律与炎症反应间的关系；进行移植早期MPO与CINC-1和CXCR2蛋白表达的相关性分析,以明确该轴在移植早期对中性粒细胞的趋化作用；Fk506干预实验用于证实CINC-1-CXCR2轴在移植早期炎症反应中所起的作用。　　 2.研究方法:　　 (1)建模及分组　　 按照第一章方法建立移植组(X,n=12)、创伤组(T,n=12)和正常组(N,n=4)动物模型。　　 (2)荧光定量PCR及蛋白检测用样本的制备　　 分别于术后D7、D30处死X组及T组大鼠,每组6只；N组4只大鼠在购买当天即处死。去皮后取下整个颊黏膜,液氮冻存备用。Trizol法提取组织总RNA,质检合格后逆转录成cDNA,冻存备用。　　 蛋白检测样本使用第二章中提取并分装的组织蛋白样本,与MPO检测所用样本来自相同的个体。　　 (3)荧光定量RT-PCR检测CINC-1、CXCR2的基因含量(以β-actin为内参)。　　 (4)ELISA法检测各组D7、D30口腔黏膜和/或颌下淋巴结中CINC-1、CXCR2蛋白水平。　　 (5)未经Fk506处理的D7各组MPO与CINC-1或CXCR2蛋白的Pearson相关性分析(2-tailed)。　　 3.结果:　　 X-D7组:CINC-1基因转录及蛋白水平显著高于正常组、T-D7组、X-D30组(P值均<0.05)；CXCR2基因转录及蛋白水平水平也高于正常组(P值分别为0.038、0.042)。　　 X-D30组:CINC-1基因转录及蛋白水平与T-D30组及正常组均无显著差别；CXCR2基因水平与T-D30组及N组无明显差异,但其蛋白水平却显著高于T-D30组及N-D30组(P值分别为0.002、0.001)。　　 FX-D7组:CINC-1、CXCR2蛋白水平在口腔黏膜的表达较X-D7组显著降低(P值分别为0.001,0.046),但仍显著高于FN-D7组(P值分别为0.001,0.018)。CINC-1的蛋白水平还显著高于FT-D7组(P<0.001),而CXCR2表达却与FT-D7组却无明显差别。此外,数据显示CINC-1、CXCR2蛋白在SMLN的表达与其它各组均无明显差别。　　 相关分析表明,MPO与CINC-1或CXCR的蛋白表达仅在X-D7组具有显著的正相关性。　　 4.结论:　　 本研究结果提示:CINC-1-CXCR2轴,作为中性粒细胞主要的趋化因子在口腔黏膜移植早期与中性粒细胞的募集关系密切；该生物轴可能通过诱导中性粒细胞促进了口腔黏膜移植后的炎症反应。