荷叶是莲科莲属水生植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的叶片,圆形,全缘或稍具波状,主产于湖北、江苏、安徽等地,2002年被卫生部列为药食同源食品。荷叶具有调脂减脂功能,可辅助治疗多种心血管疾病,如高胆固醇血症、动脉粥样硬化等,已被用于多种复方制剂,是降脂类中成药的重要原料来源。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）是普遍存在于动植物体内的一类铜结合酶,它能将酚类氧化为醌类,醌类再发生自我聚合并与其它物质结合生成褐色或黑色的色素沉淀,可以形成保护植物组织的物理屏障。但PPO在荷叶中的功能不清楚,有待进一步研究和发掘。本研究利用病毒诱导基因沉默技术（Virus induced gene silencing,VIGS）将荷叶幼苗中的PPO基因沉默后,观察其表型及生理变化,探索它对植株造成的影响及它在荷叶中的功能,为研究其它基因在荷叶中的作用奠定方法基础,也为增强荷叶抗性和提高食药用价值等方面的研究提供理论依据。本研究的主要试验结果如下:1.通多生物信息学方法,得出荷叶PPO家族具有Tyrsinase,PPO1＿DWL和PPO1＿KFDV三个结构域,长度均为600 aa左右,等电点为5.87～8.59。荷叶PPO在进化过程中被分为PPO1和AUS两簇,PPO1与AUS之间不论是结构还是功能都有较大差异。荷叶PPO含量最多的氨基酸残基是亮氨酸,占比为8.9%～9.2%,其次是脯氨酸和赖氨酸,负电荷残基数（天冬氨酸和谷氨酸）为76～79,正电荷残基数（精氨酸和赖氨酸）为67～82,总的来看,极性氨基酸大于非极性氨基酸。荷叶PPO不稳定系数均大于40,脂肪系数为69.28～84.04,总平均亲水性均小于0,说明该家族均为不稳定的亲水性脂类结合蛋白。在荷叶PPO中共找到2个活性位点,分别是酪氨酸Cu A结合区和酪氨酸Cu B结合区,且都位于酪氨酸结构域内。从荷叶PPO功能结构域可以看出,它们都有N-糖基化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,但AUS没有酰胺化位点,其中NnAUS1具有独特的细胞粘着序列RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）。2.成功构建pTRV2-PDS重组质粒,将其转化进GV3101农杆菌后注射植株叶片,发现叶片严重失绿,表明VIGS体系在荷叶中建立成功。将荷叶的3个PPO基因分别与pTRV2载体构建重组质粒,注射叶片后发现,3种沉默类型的叶片表面均出现褐色斑点,根系的根毛明显减少,其中NnPPO1沉默组和NnAUS2沉默根系几乎没有根毛。q PCR结果显示,沉默组的PPO含量明显低于对照组,说明沉默效果较好。3.荷叶中NnPPO1沉默组中除SOD外,其他3个氧化指标都低于对照组,说明沉默了NnPPO1基因后,荷叶抗氧化能力整体上有下降趋势。NnAUS1沉默组中SOD和CAT低于对照组,而POD和MDA高于对照组,表明细胞膜质过氧化程度升高,细胞膜受到损伤。NnAUS2沉默组酶活指标均明显升高,MDA几乎没有变化,说明沉默NnAUS2基因后荷叶中活性氧含量升高,生理活动异常。组织化学染色结果显示,沉默PPO基因后,荷叶中超氧阴离子和过氧化氢含量都升高,这与保护酶活性升高相对应。4.通过扫描电镜发现,与对照组叶片正面相比,NnPPO1沉默组和NnAUS1沉默组的空气囊变得扁平,而NnAUS2沉默组有部分空气囊塌陷,形成局部斑块。沉默组叶片背面的乳突数量比对照组明显减少,体积明显变小,其中NnPPO1沉默组甚至有部分细胞上没有乳突结构。说明PPO被沉默后,荷叶的正反面都发生了变化,自清洁能力和漂浮能力都受到影响。