目的:军团菌是一种在自然界和人工水系中广泛存在的革兰氏阴性杆菌,是一种胞内致病菌,可引起两种形式的军团菌病即军团菌肺炎和庞蒂亚克热（Pontiac fever）。既可引起暴发流行,又可引起散发病例。军团菌肺炎约占所有社区获得性肺炎的2-7%,它具有较高的死亡率,在未经适当治疗的免疫抑制患者中死亡率可高达80%。军团菌属包括至少58个种,其中最主要的致病菌为嗜肺军团菌,约84%的军团菌病由嗜肺军团菌血清1型导致。目前糖尿病患者合并感染嗜肺军团菌多为临床个案报道,缺乏与正常免疫力宿主感染嗜肺军团菌间病情严重程度差异的机制研究,尚无相关基础研究。本研究建立糖尿病合并嗜肺军团菌感染豚鼠模型,研究巨噬细胞胞内受体NOD1（核苷酸结合的寡聚结构域1nucleotide-binding oligomerization domain 1）表达水平以及MAPK信号通路（丝裂原激活的蛋白激酶Mitogen-activated protein kinase）信号通路的活化情况,以探讨糖尿病合并军团菌感染的免疫调节机制。研究方法:本研究分三部分,第一部分通过佛波酯（PMA）诱导的巨噬细胞,研究感染嗜肺军团菌后胞内受体NOD1表达和MAPK信号通路的活化水平。实验细胞分为两组:正常巨噬细胞染菌时间梯度组,包括嗜肺军团菌感染6h组,12h组,24h组和48h组;高糖条件下巨噬细胞染菌时间梯度组,包括嗜肺军团菌感染6h组,12h组,24h组。首先应用CCK8方法测不同浓度葡萄糖对细胞存活率的影响来确定实验所用糖浓度。应用Western blot方法检测目的蛋白NOD1的表达和MAPK信号通路的活化。此外收集每组细胞培养上清液,应用ELISA方法检测其中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平,比较高糖状态下,巨噬细胞胞内受体NOD1表达和MAPK信号通路活化水平,以及两组炎症因子分泌情况。第二部分加入NOD1抑制剂后,验证军团菌感染巨噬细胞免疫反应过程中,NOD1受体是MAPK信号通路的上游调控分子。巨噬细胞模型构建同第一部分,实验细胞共分八组:对照组,单纯抑制剂组,正常染菌组,染菌加抑制剂组,高糖组,高糖加抑制剂组,高糖染菌组;高糖染菌加抑制剂组。应用Western blot方法检测目的蛋白NOD1的表达和MAPK信号通路的活化。同样收集每组细胞培养上清液,应用ELISA方法检测其中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平。结果验证NOD1抑制剂有效,在抑制NOD1的同时,MAPK信号通路表达也受抑制,进而验证了在巨噬细胞感染军团菌的过程中,NOD1是MAPK信号通路的调控分子蛋白。第三部分研究通过STZ诱导的糖尿病豚鼠和正常豚鼠感染军团菌后胞内受体NOD1表达和MAPK信号通路的活化水平。实验分为四组:对照组,嗜肺军团菌感染组,糖尿病豚鼠组,糖尿病豚鼠军团菌感染组;三个实验时间点为嗜肺军团菌感染24h,48h和72h。应用Western blot方法检测两组豚鼠在不同时间点目的蛋白NOD1的表达和MAPK信号通路的活化水平。通过对两组豚鼠不同时间点肺组织的HE染色和免疫组化,来观察豚鼠肺组织中炎症细胞浸润和肺组织结构改变情况以及肺组织中NOD1蛋白阳性表达情况。应用Real-Time PCR方法检测其中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平。结果:第一部分对比正常和高糖状态下军团菌感染后,巨噬细胞胞内受体NOD1和信号通路MAPK的激活情况。首先采用CCK8方法检测细胞活力,葡萄糖浓度为25m M作用U937细胞6h,12h,24h与48h,U937细胞存活率为83.6%、71.6%、89.3%和80.0%。综合考虑细胞浓度以及人体血糖的情况,最终选择25m M葡萄糖浓度,作为代表高糖浓度条件进行进一步实验。将细胞分为对照组与高糖组。应用PMA诱导人组织细胞淋巴瘤细胞U937为类巨噬细胞,后通过1型嗜肺军团菌感染巨噬细胞后,应用Western blot方法检测胞内受体NOD1表达水平升高,在正常巨噬细胞感染12h,NOD1表达量达高峰,24h之后NOD1表达量逐渐下降,同时下游信号通路MAPK家族蛋白激活。在高糖感染组中,巨噬细胞感染6h后,NOD1表达量达高峰,12小时NOD1表达量开始下降。高糖状态下军团菌感染U937细胞后p38、ERK1/2、JNK蛋白表达增高,在感染6h达高峰。这些结果表明高糖状态下,嗜肺军团菌感染巨噬细胞能够活化MAPK中p38、ERK1/2、JNK信号通路。正常巨噬细胞在染菌6h,12h,24h炎症因子IL-6和TNF-α水平均高于高糖染菌组。正常染菌组巨噬细胞分泌的炎症介质TNF-α和IL-6均在感染24h达高峰,感染48h开始下降;高糖状态下巨噬细胞染菌组炎症介质TNF-α和IL-6均在感染12h达高峰,在感染24h开始下降。感染使巨噬细胞分泌炎症介质增多,高糖感染组分泌炎症介质下降时间提前,每个感染时间点糖尿病染菌组和正常染菌组比较,炎症因子TNF-α和IL-6分泌减少。第二部分加入NOD1抑制剂,进一步探究NOD1和MAPK蛋白家族在参与嗜肺军团菌感染巨噬细胞过程中的关系。采用CCK8方法检测细胞活力,NOD1抑制剂（ML130）以25u M作用6h,12h,24h和48h组细胞存活率分别为93.6%,91.1%,95.1%和93.5%。根据实验结果。最终NOD1抑制剂浓度选择25u M进行进一步实验。应用NOD1抑制剂预处理细胞,Western Blot法检测胞内蛋白NOD1的表达水平以及MAPK的磷酸化水平。与对照组相比,单独加入NOD1抑制剂组,NOD1表达水平下降,且加入抑制剂感染军团菌组与正常感染军团菌组相比,NOD1的表达水平下降。同时下游p38、JNK和ERK1/2信号通路磷酸化水平也降低。由此说明军团菌感染可使NOD1表达升高,且NOD1是MAPK通路的上游信号分子。在高糖染菌组,应用NOD1特异性抑制剂孵育巨噬细胞2h,军团菌按时间点感染巨噬细胞,Western Blot法检测胞内蛋白NOD1的表达水平以及MAPK的磷酸化水平。加入抑制剂的高糖感染Lp组与高糖感染Lp组相比,NOD1的表达水平下降。同时加入抑制剂的高糖感染Lp组下游MAPK信号通路磷酸化水平也降低。由此说明高糖状态下,巨噬细胞感染Lp可使NOD1表达升高,且NOD1是MAPK通路的上游信号分子。加入抑制剂的Lp感染组和Lp感染组相比细胞培养液中TNF-α和IL-6水平明显降低,单独加入抑制剂和空白对照组相比差异无统计学意义。可见NOD1受体的激活可以促进巨噬细胞释放炎症因子。第三部分应用STZ腹腔注射制备糖尿病豚鼠动物模型,应用STZ腹腔注射,对照组注射相同剂量的枸橼酸缓冲液。2周后进行葡萄糖耐量实验,喂糖2h后血糖大于11.1mmol/L造模成功。Lp感染组豚鼠肺组织HE染色示损伤逐渐加重,72h肺组织结构紊乱,肺泡及肺泡壁结构不清,广泛多量以中性粒细胞为主的炎性细胞渗出;糖尿病组豚鼠肺组织HE染色示结构正常,感染24h时肺泡壁可见少量中性粒细胞浸润;糖尿病合并Lp感染组豚鼠肺组织HE染色示损伤不断加重,72h肺组织结构大范围紊乱,大量肺泡腔内充满炎性渗出物,肺泡壁广泛破坏,肺泡数量减少。免疫组化结果提示,正常豚鼠感染嗜肺军团菌后,各时间点NOD1表达均增加,且高于对照组,差异有统计学意义。在感染各个时间点,糖尿病合并军团菌感染组NOD1表达低于正常豚鼠染菌组,差异有统计学意义。Western blot结果显示,军团菌感染可使NOD1表达上调。糖尿病染菌组与正常染菌组相比,在24h、48h及72h,NOD1的表达水平糖尿病染菌组均少于正常染菌组,其中24h和72h两个时间点具有统计学差异,表明糖尿病可抑制NOD1的表达。糖尿病豚鼠染菌组,在感染48h和感染24h相比表达升高,表达高峰在48h,在感染72h表达下降。糖尿病染菌组下游MAPK信号通路磷酸化水平较正常染菌豚鼠磷酸化水平低,且活化时间短。这些结果表明糖尿病豚鼠感染菌后胞内受体NOD1表达受抑制,且MAPK信号通路的免疫应答反应减弱。结论:1、嗜肺军团菌感染巨噬细胞可使胞内受体NOD1表达上调,同时激活MAPK信号通路。高糖组巨噬细胞感染军团菌后,NOD1受体活化持续时间短,炎症因子分泌较少。2、在巨噬细胞感染军团菌免疫反应过程中,NOD1是MAPK信号通路的上游调控分子,NOD1的表达与巨噬细胞分泌的炎症介质相关。3、糖尿病豚鼠感染军团菌后,肺组织NOD1受体表达受抑制,MAPK信号通路中的p38、ERK1/2、JNK蛋白活化减弱,糖尿病染菌豚鼠较正常染菌豚鼠免疫反应减弱,NOD1受体效能降低。