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目的:探讨硫化氢(H2S)对肝纤维化大鼠肝细胞增殖、凋亡的影响,研究PI3K/Akt信号通路在H2S影响肝纤维化大鼠肝细胞(HC)的增殖、凋亡中的作用,探讨H2S是否通过PI3K/Akt信号通路调节肝细胞的增殖、凋亡及胶原蛋白的表达,从而延缓肝纤维化的发生。方法:(1)采用40%四氯化碳棉籽油背部皮下注射联合高脂肪高胆固醇饲料及酒精的复合因素法建立肝纤维化大鼠模型。(2)采用胰酶两步灌流法提取肝纤维化大鼠的肝细胞。(3)提取的原代肝细胞用MTT法测定Na HS和LY294002对大鼠肝细胞的增殖抑制率(IR),分对照组与实验组,实验组按照加药浓度梯度分组:Na HS组分别按照25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度梯度给药,LY294002组分别按照25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的浓度梯度给药,均干预48小时,加入MTT 20μl暗处反应4小时,加入DMSO150μl终止反应,使用酶标仪于570nm波长处检测各孔吸光度(A)值。(4)Hoechst33342染色检测H2S与LY294002对肝细胞凋亡的影响:分4组,正常对照组(N)、Na HS50μmol/L组(S)、LY29400250μmol/L+Na HS 50μmol/L组(LYS)、LY29400250μmol/L组(LY),倒置荧光显微镜下观察并计算肝细胞的凋亡率。(5)western-blot检测PI3k、Phospho-bad蛋白的表达量:分4组,正常对照组(N)、Na HS50μmol/L组(S)、LY29400250μmol/L+Na HS 50μmol/L组(LYS)、LY29400250μmol/L组(LY),计算目的蛋白灰度值与β-actin蛋白灰度值的比值。(6)PCR法检测肝细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA的表达:分4组,正常对照组(N)、Na HS50μmol/L组(S)、LY29400250μmol/L+Na HS50μmol/L组(LYS)、LY29400250μmol/L组(LY),提取肝细胞中总RNA,PCR法检测各组细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA的表达。结果:50μmol/LNa HS,50μmol/LLY294002为最适浓度;与对照组相比,Na HS+LY294002组细胞凋亡率高(P<0.05),Na HS组细胞凋亡率低,但差异无统计学意义;Na HS组PI3k、Phospho-bad蛋白表达量高于对照组和Na HS+LY294002组,而Na HS+LY294002组PI3k、Phospho-bad蛋白表达量低于对照组和Na HS组,各组间相互比较差异均有统计学意义(P<0.05);Na HS组I、III型胶原m RNA表达量最高(P<0.05),但I型胶原m RNA表达量与对照组相比差异无统计学意义,LY组I、III型胶原m RNA表达量最低,条带最暗,差异与各组相比均有统计学意义(P<0.01),Na HS+LY组胶原表达量较LY组高,较对照组和Na HS组低(P<0.01)。结论:(1)四氯化碳复合因素法可成功建立肝纤维化动物模型;(2)两步胰酶灌流法成功提取肝纤维化大鼠的肝细胞;(3)H2S可以通过激活PI3k/Akt通路促进肝细胞的增殖,对肝细胞的凋亡抑制作用不明显;(4)H2S可促进肝细胞合成I、III型胶原蛋白,阻断PI3k/Akt通路后,I、III型胶原蛋白的合成明显减少,其机制可能与H2S通过PI3k/Akt通路调节肝细胞的增殖有关。