肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）是一种人畜共患病原菌,可引发人和动物的肺炎、败血症等疾病。该菌在人医上研究较多,而动物源报道相对较少。KP在奶牛群中主要引起奶牛乳房炎而给养殖业造成巨大经济损失。随着KP分离率的不断上升、毒性的增强以及耐药性的不断产生,对该菌进行致病性、分子流行性特征与溯源研究迫在眉睫。本研究拟通过对湖北地区5个牛场进行KP的流行病学调查、毒力特征、耐药分子特征及溯源研究,揭示KP的毒力与耐药分子机制及其潜在的传染源、传播途径,为奶牛乳房炎的精准防治提供理论基础,为临床合理用药、降低细菌耐药性的产生,减少奶牛养殖中KP污染提供科学依据。1.肺炎克雷伯菌流行性调查2019-2020年于湖北省5个奶牛场采集健康牛、隐性乳房炎和临床型乳房炎牛的乳汁、乳头皮肤拭子、肛门拭子及饲料、垫料等环境样品共计887份样品进行KP的分离鉴定。结果显示共鉴定出239株KP（26.9%）,隐性乳房炎和临床乳房炎牛的乳汁中分离率分别为24.5%和25.4%。健康牛和乳房炎牛的乳汁中KP分离率均没有显著性差异,可能是由于本研究中大部分乳房炎牛正处于治疗或恢复期。不同农场分离率存在差异可能与养殖环境卫生有关。2.肺炎克雷伯菌遗传进化分析采用wzi测序及多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing,MLST）对239株KP进行血清及基因分型,并通过构建进化树、最小生成树进行遗传进化分析,以追溯其潜在的传染源和传播途径。结果显示共鉴定出101种wzi型（32种荚膜K型）和100种ST（Sequence type）型,其中包括5种新的wzi型和25种新的ST型,但仍有40株菌的wzi型和30株菌的ST型未被分型。进化分析表明相同wzi荚膜型的菌株在基因组上存在差异,相同基因型的菌株具有不同的wzi荚膜型。100种ST型主要构成了2个克隆复合体CC20和CC200,其中分布着来自健康牛和患病牛的乳汁、皮肤拭子及饲料、垫料、粪便中的KP,这表明乳源KP与环境源的KP存在同源性。与Pub MLST数据库中来源于不同国家、不同宿主的分离株进行比较分析发现,本研究中分别有58个、67个ST型在不同国家、不同宿主中分离到,其中有60个ST曾在人类中分离到,这些基因型的菌株有跨地域和物种传播的风险。3.肺炎克雷伯菌的毒力表征采用拉丝实验、23种毒力因子的PCR检测以及小鼠致病性试验对KP进行毒力表征,分析其可能的致病机制。拉丝实验结果均为阴性。有16种毒力基因被检出,其中菌毛相关基因fim H、mrk D,脂多糖相关基因uge、wab G,铁摄取相关基因ent B、iut A、iro N以及尿素酶相关基因ure A的检出率高于85%。99.2%的KP携带至少5种毒力基因。有3株菌携带与高毒力相关的基因iuc A,挑选其中2株不同基因型的菌株,以及2株不携带iuc A的乳源多重耐药KP作为对照,进行小鼠致病性试验。结果显示10~8CFU/m L和10~9CFU/m L感染组的小鼠患有被毛粗乱、闭眼、腹泻等症状;剖检可见肝脾肿大、有结节,肺脏出血等病变;HE染色病理切片观察可见肝细胞坏死,脾巨噬细胞增生,肺泡呈现不同程度的出血,10~9CFU/m L组肺组织呈现坏死。4株菌的LD50均大于10~8CFU/m L,本研究未发现高毒力肺炎克雷伯菌。4.肺炎克雷伯菌的耐药分子特征采用微量肉汤稀释法测定分离株对17种抗生素的敏感性,并对产ESBLs的KP进行筛选;采用PCR方法测定70种耐药基因、3个整合子、5个外排泵、2个调控基因的流行情况,并分析其与耐药表型的相关性。结果显示KP对美罗培南（MEM）、多粘菌素（CT）高度敏感,而对氨苄西林（AMP）完全耐药,对磺胺异恶唑（SOX）高度耐药（94.6%）,且43.9%的分离株为多重耐药菌。乳房炎牛乳汁的KP对头孢曲松（CRO）、链霉素（STR）和庆大霉素（GEN）耐药率显著高于健康牛乳汁中的分离株,这可能主要与牛场的用药情况相关。耐药谱结果显示239株KP拥有93种耐药谱型,其中耐AMP-SOX的菌株最多（23.9%）。在239株KP中共筛选出17株产ESBLs菌株（7.1%）,其中10株（58.8%）来自乳房炎牛的乳汁。产ESBLs菌株对AMP、头孢噻吩（CEP）、头孢噻呋（EFT）、CRO、SOX完全耐药,对STR、KAN、GEN的耐药率超过50%,且均为多重耐药菌。PCR结果显示有32个耐药基因、1个整合子、4个外排泵和2个调控基因检出阳性。耐药基因bla TEM、bla SHV、str A、str B、aad A1、aac（6’）-Ib-cr的检出均超过50%。不同类别的抗生素与耐药基因的符合率均超过50%。EFT、CRO、阿莫西林/克拉维酸、STR、卡那霉素、四环素、多西环素、氟苯尼考均与相应的耐药基因呈现不同程度的正相关。而SOX、复方新诺明（SXT）和环丙沙星与单个耐药基因相关性不显著,KP对这3种药物的耐药可能还由其他机制共同介导。5.肺炎克雷伯菌的全基因组测序对17株产ESBLs菌株以及33株非产ESBLs菌株进行二代全基因组测序,分析其耐药与毒力基因流行性特征。结果显示KP均携带多种毒力和耐药基因,毒力因子以黏附素、铁摄取、分泌系统居多,耐药基因以β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药基因居多,且产ESBLs菌株中至少检出一种ESBLs类和磷霉素类耐药基因。在15株携带bla CTX-M基因的ESBLs-KP中,bla CTX-M-15最为流行。毒力基因的PCR结果与全基因组测序结果符合率均＞90%;耐药基因除bla SHV、aac（6’）-Ib-cr外,其他基因符合率均≥70%。在50株KP中有82%的菌株携带质粒复制子,共获得17种质粒复制子类型,其中Inc FIB（K）占36%。本研究评估了湖北地区5个奶牛场中KP的污染情况,揭示了其耐药和毒力分子特征及其潜在的传染源和传播途径,为奶牛乳房炎的精准防治提供了理论基础,为临床合理用药、降低细菌耐药性的产生提供了科学依据。