自上世纪40年代青霉素进入临床,大量的抗生素被发现并应用于临床治疗,为人们预防、控制以及治疗病原菌引起的感染提供了有效手段。然而,随着抗生素的广泛使用,尤其是不合理的滥用,也给细菌提供了丰富的获得耐药性的机会。耐药性细菌大量产生或增强使许多抗生素失去疗效,甚至产生超级耐药菌。菌株迅速获得抗生素抗性以及耐药性菌株的广泛传播已经向抗生素临床治疗细菌感染提出了挑战。细菌获得耐药性可以由基因突变或遗传物质的横向转移来实现,在自然条件下,基因的突变率很低；因此后者被认为是耐药性广泛传播的主要因素。遗传物质可以借助三种机制在细菌间进行传播：转化(transformation)、接合(conjugation)和转导(transduction)。转化是指细胞从环境中摄取外源DNA物质;接合是DNA在细胞间的直接转移；而转导是由噬菌体介导的DNA片段在细菌间的转移。细菌耐药性质粒除可以通过DNA-细胞(如转化),也可以通过细胞-细胞(如接合)途径获得。相比于转化方式,接合转移的效率通常很低。但对于背景不很清楚,或没有转化或转导方法的菌株,接合转移是遗传物质转移的有效途径。如在粘细菌纤维堆囊菌中,至今尚未建立转化的方法,却可以通过接合方法进行遗传操作。细菌接合转移是原核界中存在最广泛、贡献最大的基因水平转移方式。两个细胞在相互接触过程中,遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞的现象称为接合(conjugation)。大多数细菌和一些古细菌类群可以编码接合系统,存在多种接合转移单元,包括自转移接合质粒,诱动质粒,接合转座子以及一体化的接合单元。接合过程是供体和受体细胞在一定条件下通过细胞接触而建立通道,介导遗传物质的转移,并在对供体和受体细胞分别有抑制作用的双抗生素选择条件下获得接合子。由于抗生素对进行接合转移的双方细胞均有抑制或致死作用,在经典的接合转移遗传操作方法中仅在接合转移过程完成后的筛选培养基中使用抗生素,而在接合过程中并不使用抗生素。然而,我们在前期研究中发现,含有接合辅助质粒pRK2013的E. coli DH5a (λpir)与Sorangium cellulosum的接合效率在低浓度的双选择性抗生素存在下有极大的提高。该结果不但为我们对一些背景不清楚或者难以培养的微生物的遗传改造提供了一种行之有效的方法,同时也提示在低浓度双选择抗生素压力下,菌株间接合效率的提高可能具有普遍性。首先,本研究以带有不同接合转移质粒IncP pRK2013、RP4, IncW pSU2007的E.coli DH5a(供体)与HB101(受体)为模式菌株,对菌株间的接合效率进行研究。对E.coli DH5a (pRK2013)/HB101的液体接合效率在添加Kml4Sm8 (MIC)作用下,以2h为间隔进行连续20 h的统计分析,结果显示,在接合初期(2h-8h)双抗作用下的接合效率与无抗组基本一致,甚至稍低于无抗组,抗生素对供受体菌株生长的抑制起主要作用。10h时,双抗组的接合效率明显增长,迅速超过无抗组,至20 h其接合效率达到0.48,是无抗组接合效率的38倍。固体平板实验结果同样显示,相比无抗组的接合效率,添加MIC浓度双选择抗生素1 h后接合效率提高10倍以上。实验又通过供体、受体以及接合子在无抗及双抗条件下的20 h单独培养结果,证明其接合效率的提高主要是由于选择性抗生素的促进作用。其次,又通过与pRK2013同族的多抗性质粒RP4,证实双选择性抗生素对多抗质粒接合效率的提高同样具有促进作用,而且当加入三种选择性抗生素Kml4Sm20Ap34 (MIC)后, DH5α(RP4)/HB101的液体接合效率有了进一步的提高。选择性抗生素对菌株间接合的促进作用在随后对带有不同族的接合质粒IncW pSU2007的实验中也得到证实：经过20 h的接合培养,双选择抗生素作用下的接合效率提高了79.3倍。通过以上实验充分说明低浓度选择性抗生素对细菌间接合效率的提高具有普遍意义。随后,通过蛋白质组学方法,从蛋白整体表达水平上对E.coli DH5a (pRK2013)/HB101在无抗及双选择抗生素作用下的内在调控机制进行研究。提取供受体菌株在两种作用条件下的全蛋白,通过双向电泳方法建立其蛋白表达谱,并对无抗及双抗下的蛋白表达谱进行差异比对分析,得到74个发生差异表达的蛋白,60个蛋白发生下调表达,14个蛋白上调表达。通过一级和二级质谱,64个蛋白得到了一级质谱鉴定,其中的35个蛋白进一步得到了二级质谱鉴定。发生下调表达的蛋白,大部分为参与细胞基础代谢过程的酶类,这与双选择抗生素存在下,供受体细胞的生长受到选择性抗生素的交叉抑制一致。而在上调表达蛋白中,本研究对两个抗生素诱导表达的蛋白——周质空间短肽接合蛋白(OppA)和D-核糖结合周质蛋白(RbsB)进行了深入研究。通过Real-Time PCR从转录水平上验证蛋白编码基因表达量的变化,确证了该蛋白在蛋白表达谱中上调表达。Real-Time PCR结果显示,在添加双选择性抗生素条件下,oppA和rbsB基因的转录水平分别提高了3-5倍和1.7-2.8倍,与双向电泳结果一致。最后,构建了HB101(oppA)、EB101(rbsB-)两个受体单敲除突变株以及HB101(oppA-、rbsB-)受体双敲除突变株,分别以DH5a(pRK2013)、DH5α(RP4)为供体,对其在无抗、双抗及三抗作用下的接合效率与非敲除株进行对比分析,验证其基因功能。在双选择性抗生素作用下,敲除株的接合效率,在起初接合4h时,比非敲除株在无抗及双抗下的接合效率均高；而接合20 h,敲除株的接合效率比双抗下非敲除株下降明显,但仍高于无抗下非敲除株。结果显示,oppA、rbsB两个基因敲除后,供受体在双选择性抗生素作用下的接合效率在接合20 h后出现明显下降,敲除株的接合效率有回复成无抗条件下非敲除株的趋势,该结果证实oppA、rbsB两个基因确实与供受体菌株在双抗作用下的接合效率提高有关,oppA、rbsB两个基因作为供受体菌株在双选择性抗生素作用下接合的调控因子而存在。通常认为外源DNA进入受体细胞是一个异质入侵过程,本实验结果表明低活力或者低水平的代谢抑制状态,使供受体对外界的防御能力下降,更易于接受接合质粒的进入,供受体细胞被认为进入了一种更易于发生接合转移的感受状态。本研究不仅为我们对于一些背景不清楚或难以培养的微生物的遗传改造提供了一种有效的方法,而且明确提示,自然环境中存在的低浓度多种抗生素对抗性基因的传播是一个潜在的危险,它们不仅为抗性菌株提供了筛选压力,更显著提高了抗性质粒在菌株间的转移效率同时,本论文还利用蛋白质组学研究手段对一株埃博霉素产生菌纤维堆囊菌So0157-2在3种不同生长条件2个培养时间点的全蛋白表达进行研究,获得了1831个表达蛋白。结果显示,菌株So0157-2在普通发酵培养基上3天后表达蛋白552个,7天后表达蛋白529个；在特异发酵培养基上3天后表达蛋白833个,7天后表达蛋白799个；在CNST固体培养基上3天后表达蛋白804个,7天后表达蛋白718个。从而获得了纤维堆囊菌So0157-2全蛋白表达谱,建立了So0157-2全蛋白质组数据库,并对表达蛋白进行了质谱鉴定。实验对纤维堆囊菌So0157-2在3种条件下培养3天的蛋白表达情况进行横向比对,普通发酵与特异发酵培养共有485个表达相同的蛋白,普通发酵培养有66个差异表达的蛋白,特异发酵培养有318个差异表达的蛋白,So0157-2在特异发酵培养基中表达的蛋白大幅增加。So0157-2在CNST固体培养3天后,仍有366个蛋白与普通发酵、特异发酵培养表达蛋白相同,这一部分蛋白无论在何种培养条件下均有表达,其余119个蛋白只在两种发酵条件下表达。此外,在CNST固体培养3天后特异表达的蛋白273个,在两种发酵培养条件下均无表达,这一部分蛋白与纤维堆囊菌So0157-2的生长发育相关。普通发酵、特异发酵以及CNST固体培养基培养7天后,So0157-2在2DE图谱上表达蛋白分别为529、799、718个,相比同条件下3天的蛋白表达情况均有不同程度的降低。对3个条件下3天、7天的蛋白表达情况进行的纵向比对分析表明,3个条件下分别有56.7%,54.3%,72.6%的蛋白发生共表达,同时有少部分蛋白在各自培养时间下发生差异表达,为研究So0157-2在不同生长发育条件下的蛋白表达以及细胞代谢调控提供了重要依据。本文对每种条件下确证表达的蛋白进行质谱鉴定,在普通发酵培养3天条件下474个蛋白得到了鉴定,鉴定率85.9%。其中根据基因序列推测的未验证功能的蛋白106个,占比22.4%；得到鉴定的已知蛋白包括细胞结构组分以及细胞代谢合成酶类等。更引人关注的是,本研究得到了17个跟糖代谢转化相关的蛋白,有助于本实验糖基化埃博霉素的深入研究。