真核生物mRNA前体一般都包括外显子序列和内含子序列,mRNA的成熟需要对前体mRNA进行内含子剪切和外显子拼接的加工步骤。当这种加工发生在同一个mRNA前体分子时,称为顺式剪接。发生在不同mRNA前体分子的剪接称为反式剪接,这一种剪接方式并不像顺式剪接那样常见。尽管对于反式剪接这种剪接机制的研究和认识要远远的比不上顺式剪接,但是反式剪接因为其重要的理论意义和应用价值已经得到了广泛的关注。大多数基因治疗针对的都是DNA,而利用反式剪接这种机制对RNA进行基因治疗已经成为当前最有前途的基因治疗手段之一。反式剪接主要存在像椎体虫、线虫等低等真核生物中。虽然有报导在包括人等高等哺乳动物中发现存在反式剪接的现象,但是人们普遍认为,反式剪接这一种剪接机制在哺乳动物等高等生物中是非常稀少的,相对于顺式剪接所产生的转录本是可以忽略不计的。有很多研究通过生物信息方法在公共的序列数据库发现大量的嵌合体基因,但是他们认为这些嵌合体序列都是来自于染色体易位或者人工嵌合体,而不是反式剪接。随着第二代测序技术的发展,公共序列数据库中积累了大量的来源于生物体内转录本的32nt左右的短的RNA-Seq序列。本文结合EST/mRNA序列和RNA-Seq序列,在基因组的水平上预测反式剪接。通过这种方式,既能够排除人工嵌合体,同时也能够排除染色体易位,因为人工嵌合体和染色体易位偶然性比较强,同时存在于不同个体或者不同实验的概率非常低,而反式剪接作为一种剪接机制不存在这种偶然性。通过不同来源的序列的交叉验证,可以筛选具有较高可信度的反式剪接嵌合体。最近在古细菌中发现的断裂tRNA基因表明不仅mRNA可以进行反式剪接,类似tRNA这种分子也有可能进行着反式剪接。某些tRNA基因的5’端半分子和3’端半分子位于基因组的不同座位分别转录的,然后在RNA水平上进行反式剪接形成成熟的tRNA分子。本文从古细菌、真细菌以及真核生物的基因组中分析可能的断裂tRNA基因,在进化上讨论断裂tRNA基因通过反式剪接形成成熟的tRNA分子这一现象。主要研究结果如下：1、反式剪接的基因组水平分析首先利用人类和小鼠的EST/mRNA序列初步预测嵌合体EST/mRNA。在人类和小鼠中分别得到53,074和19,151条嵌合体EST/mRNA。然后通过基因组座位将冗余的嵌合体EST/mRNA去掉,最后在人类中得到45,942条非冗余的mRNA嵌合体,在小鼠中得到15,315条非冗余的mRNA嵌合体。然后利用RNA-Seq序列筛选反式剪接嵌合体。总共从人类的44228个候选嵌合体中筛选出1235条有RNA_Seq支持的嵌合体,从小鼠的14575个候选嵌合体中筛选出1129条有RNA_Seq支持的嵌合体。这些经过最终筛选得到的反式剪接嵌合体具有较明显的染色体偏好性。比如人类中的嵌合体在21号染色体上非常的丰富,而在5号、10号和14号染色体上分布的非常的少。对反式剪接可能的机制进行了初步的分析和探讨。发现大部分的反式剪接的上游转录本和下游转录本在拼接处(junction)有重叠的碱基(human:77%; mouse:76%),称之为重叠拼接(overlapped junction);只有极少部分的反式剪接的上游转录本和下游转录本是恰好拼接而形成嵌合体(human:5%; mouse: 7%),称之为精确拼接(exact junction);另外还存在一部分反式剪接在拼接处有一段序列既不存在于上游转录本,也不存在于下游转录本(human:18%;mouse: 17%),我们将这种拼接方式称为缺失拼接(gapped junction)。我们检测了反式剪接形成的嵌合体是否编码新的嵌合体蛋白。在人类中有64%的反式剪接嵌合体能够编码新的蛋白,在小鼠中有66%的反式剪接嵌合体能够编码新的蛋白。这表明,反式剪接跟选择性剪接一样,对蛋白质组的多样性有很大的贡献。同时对参与反式剪接的基因进行了功能注释。人类的核糖体蛋白(ribosomal protein)、核酸结合(nucleic acid binding)以及细胞骨架蛋白等分子功能的基因更加倾向于发生反式剪接,而受体分子等分子功能的基因发生反式剪接的比较少；在小鼠中钙粘蛋白、细胞粘着分子以及氧化还原酶等分子功能的基因比较倾向于发生反式剪接,受体分子等分子功能的基因比较少见发生反式剪接。本研究还分析了染色体相互作用与反式剪接的关系。首先染色体之内的反式剪接要比染色体间的反式剪接明显要多。同一条染色体在空间上比不同的染色体在空间上更接近,更容易发生相互作用。因此染色体的相互作用有利于发生反式剪接。进一步利用Hi-C数据验证了这个观点。分别在人类和小鼠中选取部分预测得到的反式剪接进行PCR验证,证实了其中一部分反式剪接的存在。最后将预测得到的反式剪接数据导入Mysql数据库,并用PHP开发出一个动态网站TRSDB展示反式剪接的结果。可以通过TRSDB浏览每一个反式剪接的具体信息,包括染色体定位、参与反式剪接的基因注释、剪接方式等。还可以通过基因名字、基因ID或者accession号码在TRSDB中搜索反式剪接。2. tRNA的进化：从断裂基因到连续基因首先发现从低等的古细菌到高等的人类、小鼠等脊椎动物,tRNA基因的基因组上下游都呈现出保守的单核苷酸替代模式：越靠近tRNA基因单核苷酸替代越富集。这一模式与缺失／插入一致,表明tRNA基因可能来源于缺失／插入。为了进一步得到tRNA基因是来源于缺失／插入的证据,分析了脊椎动物和昆虫的进化历史,分别在脊椎动物的基因组多序列比对中和昆虫的基因组多序列比对中找到18例和5例tRNA基因的缺失插入。通过同源搜索方法证实了tRNA半分子同源序列在大量物种的基因组中普遍存在。然后通过分析tRNA基因的方法分析tRNA半分子同源序列的上下游基因组的单核苷酸替代频率,发现tRNA半分子同源序列附近的单核苷酸替代并不像tRNA基因附近的单核苷酸替代那样富集,表明在现在的基因组中,tRNA半分子同源序列没有tRNA基因活跃。还发现tRNA半分子同源序列与逆转座元件相关。在小鼠和人类中用CAGE标签检测到tRNA半分子同源序列的表达,并在小鼠中用RT-PCR进一步验证。以上结果表明tRNA半分子基因要比tRNA基因古老,tRNA半分子同源序列可能是tRNA半分子基因的进化痕迹,tRNA半分子基因具有逆转座的功能,在RNA水平上形成完整tRNA分子,通过逆转座插入到基因组,然后进化成完整的tRNA基因。