研究背景:膀胱癌(Bladder cancer)是一种较常见的恶性肿瘤,发病率呈逐年增长的趋势,治疗效果及预后差,严重危害人类的健康。其确切的发病机制尚未完全清楚,寻找新的生物学靶标用于膀胱癌的监测和干预,成为膀胱癌防治迫切需要解决的问题。目前的研究表明肿瘤微环境与膀胱癌的发生发展和预后密切相关,T细胞在其中发挥着重要作用。但目前的研究大多是基于T细胞亚群的变化和分子分型,而我们需要更深层次的了解与肿瘤抗原结合的T细胞受体(T cell receptor,TCR)的序列信息和多样性变化。而免疫组库是研究B细胞受体重链、轻链,T细胞受体α、β、γ和δ链可变区的免疫系统多样性,可深入挖掘免疫组库与疾病的关系。第二代高通量测序(High-throughput sequencing,HTS)是一种大规模并行的测序技术,与Sanger测序相比能在更低成本的基础上更快地得到高通量数据,一次可对几十万到几百万DNA分子进行序列测定,能够对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析。目的:探讨膀胱癌患者的T淋巴细胞免疫图谱的复杂性和多样性,客观准确地评估膀胱癌的免疫状态,阐明膀胱癌的病因学及发病机制,为疾病预防、诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。方法:收集5例手术切除新鲜冻存的膀胱癌组织(癌组织组)及其癌旁组织(对照组),分别从各组织中提取全基因组DNA。通过设计各V区家族和J区家族引物,扩增出TCR的所有CDR3区,再结合新一代高通量测序技术和平台,分析癌组织组和对照组中T细胞TCRβ链CDR3区多样性、长度分布特征及各基因家族的表达频率等;比较CDR3氨基酸序列长度分布的正态性,V区、D区、J区和V-J组合区基因使用频率分布,个体TOP 20 V基因使用情况;从海量数据中筛选癌组织组和对照组中高度克隆性扩增的DNA序列(频率大于0.5%)、氨基酸序列(频率大于0.5%)、V-J组合(频率大于1%),及独有/共有DNA序列、氨基酸序列和V-J组合;此外,根据香农熵分析癌组织组与对照组中的TCR多样性差异和克隆表达差异。揭示膀胱癌组织和癌旁组织中T淋巴细胞的免疫特性,阐明膀胱癌病理生理机制并寻找新的生物标志物、免疫治疗靶点。结果:1、长度分布频率:癌组织组中TCRβ链CDR3氨基酸序列的长度分布频率最大的5个为14,1 1,12,13和10nt,对照组中最大5个为1 1,13,12,10和14nt;癌组织组和对照组的高斯分布拟合值分别为0.83和0.98。表明对照组的CDR3氨基酸序列长度分布比癌组织组更趋向于正态分布。2、克隆性扩增程度:与对照组相比,癌组织组T细胞高度克隆性扩增(频率大于0.5%)的DNA序列、氨基酸序列增加,且总体克隆性扩增程度增加。3、TCR多样性:通过计算癌组织组和对照组的香农熵系数(0.40 vs 0.59),发现癌组织组的免疫组库多样性低于对照组。4、高度克隆性扩增(HEC)序列:统计分析后筛选出癌组织组和对照组中表达的高度克隆性扩增的DNA序列(32 vs 14)、氨基酸序列(35 vs 14),只存在于癌组织组的5条高度克隆性扩增DNA序列和7条高度克隆性扩增氨基酸序列。5、癌组织组和对照组间的TRBV、TRBD、TRBJ及V-J组合的表达频率存在明显差异。结论:1、与癌旁组织相比,膀胱癌组织内的T细胞克隆性扩增程度增加,T细胞免疫组库多样性较低。2、免疫组库测序可以从DNA序列、氨基酸序列和V-J组合水平全面了解膀胱癌组织和癌旁组织TCR CDR3的多样性和特征谱,可以客观准确地评估膀胱癌免疫状态,有助于深入认识膀胱癌发病机制,开发免疫治疗的靶点、预后监测的生物标志物。