本课题首先利用DNA双链断裂诱导重组的原理开发了一套高效无痕遗传修饰系统,并利用该技术通过逆向代谢工程策略,将鉴定的核黄素高产有利突变通过等位基因置换至枯草芽孢杆菌野生菌,重构了一株核黄素生产菌。进～步利用理性代谢工程策略,代谢工程修饰核黄素合成途径和嘌呤合成途径,获得高产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌株。建立枯草芽孢杆菌高效无痕遗传修饰系统。通过过表达枯草芽孢杆菌感受态细胞形成的关键基因comK,实现底物诱导快速形成超级感受态细胞；构建upp为负筛选标记宿主菌,融合PCR获得修饰片段,Ⅰ-SceⅠ诱导DNA双链断裂的重组修复,可实现连续/迭代地等位基因置换、基因插入、敲除及基因组大片段删除。外源dsDNA片段的重组效率高达3000～5000 cfu/μg dsDNA,是传统Spizizen转化效率100倍以上。DNA双链断裂诱导的修复,使短同源区(30 bp)重组效率提升10-100倍。通过无痕遗传修饰系统,以敲除upp基因的B. subtilis BSW4作为基础菌株,将鉴定的核黄素高产有利突变(ribC, ribG+,purA,ccpN, yhcF, ywaA,yvrH)迭代引入,重构一株核黄素生产菌BSW54。摇瓶发酵验证工程菌BSW54产量达到298.90 mg/L,与仅含ribC突变点BSW5菌株相比,核黄素产量提升496.01%。在重构菌BS77基础上过表达核黄素操纵子基因。过表达ribA基因构建工程菌BS89,核黄素产量为506.45 mg/L,较宿主菌BS77提高1.4倍,同时核黄素比生成速率从32.85±2.66μmol·g-1CDW·h-1提高至41.65±1.51μmol·g-1CDW·h-1 RT-PCR结果显示工程菌BS89的核黄素操纵子基因转录水平显著提升2倍,说明ribA基因过表达能够显著提高核黄素合成途径代谢通量。然而,利用P43置换一级启动子ribPl与ribO区域以及ribO区域敲除的两种组成型过表达核黄素操纵子实验策略,均未取得理想效果。通过解调嘌呤合成途径转录水平和解除关键酶反馈抑制作用提高核黄素的产量。敲除嘌呤途径阻遏蛋白purR和关键调控区域att,构建工程菌BS104,其嘌呤途径基因的转录水平最高提高近380倍。进一步过表达PurF突变酶(D293V、 K316Q和S400W),显著提升PRPP转酰胺酶活性,部分解除嘌呤核苷类物质的反馈抑制。胞内代谢物谱分析表明,核黄素合成前体物GTP浓度显著提高。工程菌BS110的核黄素产量达到826.52 mg/L,较重构菌BS77提高3倍。