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第一部分探究巨噬细胞钙敏感受体通过TRPC6/Ca2+信号促进炎症反应目的:观察钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)对RAW264.7细胞炎症反应的影响,并探讨其分子机制。方法:采用Fura-2 AM荧光探针对RAW264.7细胞浆内Ca2+进行荧光染色,CaCl2及CaCl2+Calhex231对细胞进行干预,荧光钙离子浓度检测仪检测并记录CaSR对RAW264.7细胞胞浆内钙荧光强度的影响。分别在RAW264.7细胞及腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PMs)上进行药理学干预,然后进行荧光钙离子浓度检测,探究细胞系及原代细胞之间CaSR引起胞内钙信号变化的差异。在0Ca2+、2Ca2+PSS条件下,探究RAW264.7细胞CaSR产生钙信号的来源。分别使用GSK1016790A、SKF96365和SAR7334干预RAW264.7细胞,检测外钙内流的主要钙通道。q-PCR检测IL-1β和IL-18 mRNA表达;ELISA检测IL-1β蛋白含量。结果:CaSR激动剂CaCl2显著增加RAW264.7胞内钙荧光强度,而CaSR拮抗剂Calhex231可抑制此作用。CaCl2及cinacalcet(CaSR特异性激动剂)都能引起Ca2+信号增加,此作用可被Calhex231及瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6,TRPC6)抑制剂SAR7334所抑制(P<0.05)。q-PCR结果显示,LPS组IL-1β和IL-18mRNA表达显著高于对照组;cinacalcet进一步增加其表达,而Calhex231及SAR7334可显著抑制此作用(P<0.05)。ELISA结果显示,与LPS比较,cinacalcet增加IL-1β蛋白分泌(P<0.05),而此结果可被Calhex231及SAR7334抑制(P<0.05)。结论:在巨噬细胞上,激活CaSR通过TRPC6引起胞内Ca2+浓度增加,进而促进IL-1β及IL-18的分泌,最终促进了可能的炎症反应。第二部分探究钙敏感受体通过TRPV4/Ca2+信号促进M1型巨噬细胞极化目的:观察激动CaSR对巨噬细胞表型及功能的影响,并探讨其分子机制。方法:使用免疫荧光检测CaSR在PMs细胞上的表达。采用荧光钙离子浓度检测仪进行以下实验:使用NPS2143孵育(或者未孵育)PMs细胞,再分别使用两种不同的CaSR激动剂CaCl2、cinacalcet对PMs细胞进行刺激,检测它们分别对PMs细胞Ca2+信号的影响;在0Ca2+、2Ca2+PSS条件下,检测spermine、cinacalcet对PMs细胞上Ca2+信号的影响,从而探究CaSR激动后钙信号的来源;分别使用SKF96365、HC067047孵育PMs细胞,再分别使用CaCl2及cinacalcet刺激,筛选出瞬时受体电位香草酸亚型4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是CaSR激动后引起外钙内流的主要钙通道之一;采用WT及TRPV4敲除(transient receptor potential vanilloid 4 knock-out,TRPV4 KO)小鼠PMs验证TRPV4通道是CaSR激动后引起外钙内流的重要通道之一;采用药理学干预,使用荧光钙离子浓度检测,进一步探究CaSR与TRPV4通道是如何耦联的。上述从机制上探究了巨噬细胞上CaSR是如何产生钙信号,后续将继续进行功能的研究。为探究CaSR对巨噬细胞表型及功能的影响,将PMs细胞随机分为4组:(a)Control组(DMSO,v/v<0.1%),(b)LPS组,(c)LPS+CaCl2组,(d)CaCl2组。LPS(终浓度100 ng/mL)处理8 h,而后CaCl2(终浓度5 mmol/L)处理4 h。Q-PCR、蛋白免疫印迹实验检测CCR7及CD206的表达情况。将PMs随机分为6组:(a)Control组(DMSO,v/v<0.1%),(b)LPS组,(c)LPS+CaCl2组,(d)LPS+CaCl2+NPS2143组,(e)CaCl2组,(f)NPS2143组。LPS(终浓度100ng/mL)处理8 h,8 h后加入CaSR拮抗剂NPS2143(终浓度10μmol/L)及CaSR激动剂CaCl2(终浓度5 mmol/L)处理细胞4 h。收取细胞培养液,离心取上清,ELISA检测炎症因子(IL-1β、TNFα)蛋白分泌。使用Trizol裂解细胞,提取总mRNA,q-PCR检测IL-1β和TNFαmRNA表达量。为探究TRPV4是否参与巨噬细胞表型调控作用,将WT及TRPV4 KO PMs分别分为2组:LPS组及LPS+CaCl2组。同前述LPS 100 ng/mL处理8 h。8 h后加入CaCl2(终浓度5 mmol/L)处理4 h。收取细胞上清液及裂解液。Q-PCR及ELISA检测IL-1β及TNFαmRNA表达及蛋白分泌量。结果:在PMs细胞中有CaSR表达,主要定位于胞膜及胞浆,两种不同的CaSR激动剂CaCl2、cinacalcet显著增加PMs胞内钙信号,而CaSR拮抗剂NPS2143可抑制此作用(P<0.0001)。PLC抑制剂U73122、IP3R抑制剂2-APB和xestospongin C以及ER钙螯合剂TPEN可分别抑制CaSR激动剂引起的钙信号增高(P<0.05)。CaCl2及cinacalcet都能引起Ca2+信号增加,此作用可分别被TRPC及TRPV4抑制剂SKF96365、HC067047所抑制(P<0.05)。在PMs细胞中有TRPV4表达,主要定位于细胞膜。CaCl2、cinacalcet在TRPV4 KO PMs产生钙信号较WT PMs明显减低(P<0.05)。Cinacalcet显著增加PMs胞内钙信号,此作用可分别被NPS2143及U73122抑制,而TRPV4 KO后此两者的抑制作用增加(P<0.05)。在HEK293T细胞中,单独使用cinacalcet不会引起胞内钙信号增加,而加用GSK1016790A后钙信号显著增加。与单独使用GSK1016790A比较,两者无统计学差异。在PMs细胞上,PLA2抑制剂MAFP以及CYP450抑制剂Miconazole均可抑制CaCl2及cinacalcet引起的钙信号增加(P<0.05)。TRPV4 KO PMs中PKC激动剂PMA引起的钙信号较WT PMs中减低(P<0.0001)。Q-PCR与蛋白免疫印迹实验均提示CaCl2促进CCR7表达。LPS组IL-1β和TNFαmRNA表达显著高于对照组;CaCl2进一步增加其表达,而NPS2143及TRPV4 KO可显著抑制此作用(P<0.05)。ELISA结果显示,与LPS比较,CaCl2增加IL-1β和TNFα蛋白分泌(P<0.05),而此结果可被NPS2143及TRPV4 KO抑制(P<0.05)。结论:在PMs细胞上,CaSR和TRPV4通道通过PLA2/CYP450和PLC/PKC通路耦合,促进了Ca2+依赖性M1型巨噬细胞极化。这种耦联及其下游途径的调节可能成为预防或治疗免疫相关疾病的潜在策略。