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第一部分研究Ku80分子表达对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响实验目的：探讨Ku80分子表达对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响。实验方法：1.从国外交流获得pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表达质粒；将质粒转化到DH5α感受态细菌中,培养扩增细菌；小量提取质粒鉴定无误后,继续扩增细菌,大量提取并纯化质粒,最后测序鉴定。2.将pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表达质粒转染到不表达Ku80的SMMC7721肝癌细胞中,通过G418筛选获得稳定表达Ku80的细胞克隆,western blot鉴定Ku80蛋白表达阳性的SMMC7721细胞克隆。3.直接细胞计数和软琼脂克隆形成实验检测高表达Ku80的SMMC7721肝癌细胞克隆与对照细胞株的体外增殖能力。4.将高表达Ku80的SMMC7721肝癌细胞克隆和对照细胞株分别接种到裸鼠皮下,研究接种各组细胞形成皮下肿瘤的生长情况和裸鼠的生存时间。实验结果：1.经鉴定成功获得可供细胞转染用的pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表达质粒。2. Western blot检测证实成功筛选获得稳定高表达Ku80蛋白的细胞克隆3个：Ku80-18, Ku80-26和Ku80-33,及转染空质粒的对照组细胞克隆(Vector)。3.直接细胞计数显示,Ku80-18克隆细胞(1.715±0.242,×104)和Ku80-26克隆细胞(1.595±0.303,×104)在生长至第5天的细胞数目与对照组Vector细胞(4.408±1.486,×104)或SMMC7721细胞(5.592±0.906,×104)相比明显减低(p<0.01)；Ku80-18克隆细胞(2.223±0.481,×104)和Ku80-26克隆细胞(2.025±0.075,×104)在生长第7天的细胞数目与对照组Vector细胞(6.733±0.651,×104)或SMMC7721细胞(7.03±0.219,×104)相比明显减低(p<0.01)。软琼脂克隆形成实验显示,Ku80-18克隆细胞(53±7个)和Ku80-26克隆细胞(50±7个)在软琼脂中形成细胞克隆的数目与对照组Vector细胞(109±6个)或SMMC7721细胞(117±9个)相比明显减低(p<0.01)。4.裸鼠皮下移植瘤生长至44天,绘制其生长曲线发现,Ku80-18和Ku80-26克隆细胞形成的皮下瘤生长速度在24天后明显低于Vector或SMMC7721细胞(p<0.01)；第44天,Ku80-18克隆细胞(1.66±0.39cm3)和Ku80-26克隆细胞(1.50±0.31cm3)形成皮下瘤的平均体积与对照组Vector细胞(3.19±0.39 cm3)或细胞SMMC7721(3.04±0.51cm3)相比明显减低(p<0.01)；Ku80-18克隆细胞(0.1425±0.0712g)和Ku80-26克隆细胞(O.1300±0.0404g)形成皮下瘤的平均重量与对照组Vector细胞(O.5497±0.1273g)或SMMC7721细胞(0.6071±0.1729g)相比明显减低(p<0.01)。Vector细胞接种的裸鼠中位生存时间为52.0±±1.1天,Ku80-18细胞接种的裸鼠中位生存时间为69.0±±2.2天；Ku80-18组裸鼠与Vector组裸鼠相比中位生存时间延长率为32.8%；Vector和Ku80-18细胞接种裸鼠的中位生存时间的差异具有显著的统计学意义(p<0.01)。第二部分研究Ku80分子表达对SMMC7721肝癌细胞增殖影响的分子机制实验目的：研究Ku80表达对SMMC7721肝癌细胞增殖影响的可能分子机制。实验方法：1.流式细胞术检测高表达Ku80的SMMC7721细胞克隆和对照细胞株的细胞周期分布。2.流式细胞术检测高表达Ku80的SMMC7721细胞克隆和对照细胞株的凋亡水平3. Western blot检测高表达Ku80的SMMC7721细胞克隆和对照细胞株细胞周期相关蛋白的表达水平。4. Western blot检测高表达Ku80的SMMC7721细胞克隆和对照细胞株凋亡相关蛋白的表达水平。5.免疫组织化学检测接种各组细胞形成的裸鼠皮下瘤组织中细胞周期蛋白的表达水平；TUNEL法检测接种各组细胞形成的裸鼠皮下瘤组织中细胞凋亡水平。6.将靶向干扰p53和p21表达的三个siRNAs分别命名为sip53-1, sip53-2 sip53-3和sip21-1, sip21-2, sip21-3。按照说明书步骤,使用Lipofectamine 2000将这些siRNAs转染到Vector和Ku80-18细胞中；Western blot检测干扰效果；将干扰后的各组细胞置于37℃5% CO2环境中培养,在不同的时间点收集细胞,检测各组细胞增殖能力和细胞周期分布(方法同前)。实验结果：1.流式细胞术检测细胞周期分布显示,经过10%胎牛血清刺激O,12,24,36和48小时后,Vector细胞的S期比率分别为37.10±3.83%、34.56±3.32%、34.89±4.24%,、39.8±5.48%和29.72±6.50%,Ku80-18细胞的S期比率分别为53.70±4.77%、71.88±4.46%、74.144±3.70%、85.46±4.08%和77.84±4.15%,两组细胞在各个时间点的S期比率差异都具有明显的统计学意义(p<0.01)。2.流式细胞术检测细胞凋亡显示,SMMC7721细胞的凋亡比率是1.81±0.15%, Vector细胞的凋亡比率是1.83±0.25%,Ku80-18克隆细胞的凋亡比率是9.444±1.52%,Ku80-26克隆细胞的凋亡比率是9.26±1.72%；Ku80-18克隆细胞和Ku80-26克隆细胞的凋亡比率与SMMC7721细胞或Vector细胞的凋亡比率相比差异具有显著的统计学意义(p<0.01),而SMMC7721细胞与Vector细胞的凋亡比率相比差异无显著的统计学意义(p>0.05),Ku80-18细胞克隆与与Ku80-26细胞克隆的凋亡比率相比差异也无显著的统计学意义(p>0.05)。3. Western blot检测发现,Ku80-18和Ku80-26细胞克隆中p53和p21蛋白的表达水平与对照组细胞SMMC7721或Vector相比明显增高,cyclinA和cdk2蛋白的表达水平减低,cylinE蛋白表达水平无明显差异。4. Western blot检测发现,Ku80-18和Ku80-26细胞克隆中cleaved PARP, caspase-3和caspase-8表达水平与对照组细胞SMMC7721或Vector相比明显增高,Bcl-2表达水平减低,而Bax表达水平无明显变化。5.免疫组织化学检测发现Ku80-18细胞接种的裸鼠皮下瘤组织与Vector细胞接种的裸鼠皮下瘤组织相比,p53和p21蛋白的阳性表达率明显增高(p<0.01), cyclinA和cdk2蛋白的阳性表达率明显降低(p<0.01), cyclinE蛋白阳性表达率的差异无显著统计学意义(p>0.05)。TUNEL法检测裸鼠皮下瘤组织的细胞凋亡水平发现,SMMC7721组的凋亡率是3.5±1.0%,Vector组的凋亡率是3.6±1.1%,Ku80-18组的凋亡率是9.3±2.0%,Ku80-26组的凋亡率是10.O±2.1%；Ku80-18组和Ku80-26组的凋亡率与SMMC7721组或Vector组相比差异具有显著的统计学意义(p<0.01), SMMC7721组的凋亡率与Vector组相比差异无显著的统计学意义(p>0.05),Ku80-18组凋亡率与Ku80-26组相比差异无显著的统计学意义(p>0.05)。6.细胞周期检测显示,Ku80-18细胞在转染sip53-3或sip21-1 72小时后S期的比率与Vector细胞相比差异无显著的统计学意义(p>0.05)。此外,Vector细胞在转染mock, sip53-3或sip21-1后各个时间点的S期比率差异无显著的统计学意义(p>0.05)。细胞增殖实验进一步发现,Ku80-18细胞在敲减p53或p21分子表达第5天后的细胞数目与转染mock的Ku80-18细胞相比差异具有显著的统计学意义(p<0.01)。与转染1mock的Ku80-18细胞相比,Ku80-18细胞在转染sip53-3或sip21-1后生长至第5天细胞数目平均增加253%或245%。转染mock, sip21-1和sip53-3的Vector三组细胞在各个时间点比较,细胞数目在各组间差异均无显著的统计学意义(p>0.05)。统计学分析所有实验结果皆重复三次,以上所有数据均以均数±标准差形式表示,并应用SPSS17.0软件进行统计学分析,各组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),分类变量的比较采用卡方检验或Fisher精确检验,采用Kaplan Meier法进行生存分析,若p<0.05则认为差异具有显著的统计学意义。结论1.在体外增殖实验和体内裸鼠成瘤实验中,高表达Ku80蛋白可明显抑制SMMC7721细胞株的增殖能力。2.Ku80高表达可引起SMMC7721肝癌细胞阻滞在S期,并伴随着细胞凋亡增加。3.Ku80高表达可上调p53和p21蛋白表达水平。4.Ku80抑制肝癌细胞增殖和引起细胞周期S期阻滞的分子机制依赖于p53-p21通路的激活。