化疗药物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是治疗乳腺癌的一线药物。但由于PTX水溶性较小、靶向性较差、毒副反应强,限制了其临床应用。PTX的第一个商用配方Taxol(?)以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor(?)EL)和无水乙醇以1:1的比例作为溶剂。但配方中所含的聚氧乙烯蓖麻油易导致严重的过敏反应、肾毒性与神经毒性,患者的耐受性较差。为了增大PTX的水溶性与靶向性,提高制剂的安全性,本课题设计了一种具有双敏感特性的前药纳米载体,用来递送化疗药物PTX。根据肿瘤组织谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度较高与金属基质蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)过表达的特性,设计的纳米粒具有氧化还原与MMP-2酶双敏感性,并可实现程序化药物释放。另外,加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)用来主动靶向乳腺癌细胞上过表达的SPARC受体。课题研究主要包括以下四部分内容:1.含二硫键的PTX前药与巯基化明胶(Gel-SH)的合成及表征首先,利用 PTX、3,3’-二硫代二丙酸酐(dithiodipropionicanhydride,DTDPA)合成含二硫键的紫杉醇前药PTX-SS-COOH。接着,利用明胶与对巯基苯甲酸的酰胺化反应合成巯基化明胶(Gel-SH)。最后,将PTX-SS-COOH与Gel-SH在混合溶剂中进行酰胺化反应,得到巯基化修饰的两亲性聚合物Gel-SS-PTX。产物通过紫外分光光度法(UV)、核磁共振氢谱法(1H-NMR)及傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)验证了上述物质成功合成。通过Ellman法测得Gel-SH中巯基含量为55.88 μmol/g。2.BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH纳米粒的制备及理化性质的考察通过一步制备法制备了 BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH双模式载药纳米粒,测定了纳米粒的载药量。分别利用透射显微镜法(transmission microscopy,TEM)、动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)、花荧光探针法考察了纳米粒的外观形态、粒径分布、Zeta电位及临界聚集浓度(critical aggregation concentration,CAC)等物理化学性质。结果显示,按照最优处方制备的双模式载药纳米粒载药量约为28.71%,其外观形态良好,呈光滑圆球形;粒径约为124.4±1.32 nm,分布均匀,Zeta电位为-1.47±0.278 mV;临界聚集浓度为0.0355 mg/mL。3.双模式载药纳米粒的体外评价将BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH双模式载药纳米粒在不同pH值下与MMP-2酶孵育不同时间后,通过测量粒径及粒径分布变化证明了纳米粒的酶敏感性。利用透析袋法,测定了 Gel-SH/PTX-SS-COOH纳米粒、Gel-SS-PTX纳米粒与BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH纳米粒在不同氧化还原水平的释放介质中的体外释药情况,发现当存在10 mM D,L-二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)时,纳米粒的释药速度与累积释放量均明显上升,证实了其氧化还原敏感性。利用鼠系黑色素瘤细胞(B16细胞)与人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)为细胞模型,评价了纳米粒的体外抗肿瘤活性、细胞摄取能力、诱导细胞凋亡能力与消耗细胞内GSH的能力,并通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)证明了纳米粒的主动靶向性。4.双模式载药纳米粒的体内药效学评价在小鼠的右侧腋下注射鼠系黑色素瘤细胞(B16细胞)建立荷瘤小鼠模型,通过尾静脉注射生理盐水、Taxol(?)制剂与BSA/Gel-SS-PTX/PTX-SS-COOH双模式载药纳米粒,并以小鼠瘤体积与体重为指标评价了纳米粒的体内抗肿瘤活性与体内安全性。与生理盐水组相比,Taxol(?)治疗组与纳米粒治疗组的小鼠肿瘤体积均无显著增长,说明两种制剂的治疗效果较好;但Taxol(?)治疗组的小鼠体重下降明显,纳米粒治疗组小鼠的体重略有上升,说明与Taxol(?)相比,纳米粒的毒副作用较小。将各组小鼠的正常组织与肿瘤组织剥离后,进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E staining)后发现,生理盐水组与纳米粒治疗组小鼠的正常组织均正常,而Taxol(?)治疗组小鼠表现出肝毒性与肾毒性,进一步证明了纳米粒有较好的体内安全性。