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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的癌症之一,在男性常见癌症中排名第五,女性常见癌症中排名第七,死亡率在癌症中排名第三。全世界每年有超过70万的新发肝癌病例,其中50%以上在中国,约36万人,因此我国是一个肝癌大国。肝癌发生的主要危险因素有HBV感染、HCV感染、酗酒和黄曲霉素摄入等。目前,肝癌手术切除仍然是治疗肝癌的最有效方法。随着手术方式不断改进,肝癌手术切除率大为提高,术后5年生存率也提高到50%～60%。然而,与其他消化道恶性肿瘤相比,HCC的外科治疗效果尚不能令人满意。术后肿瘤复发与转移是患者不能长期生存的主要原因。肝癌复发转移又是一个十分复杂的过程,因此只有深入了解肝癌侵袭转移的分子机制并寻找有效的治疗靶点,才能从根本上达到根治肝癌的目的。随着对肿瘤认识的不断深入,人们意识到肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)与肿瘤的发生和发展密切相关。肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌,改变和维持自身生存和发展的条件,促进肿瘤的生长和发展。全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变,限制和影响肿瘤的发生和发展。提示不同成分的TME对肿瘤的作用具有异质性。TME是由肿瘤细胞、肿瘤所在组织细胞、基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成。其中基质细胞包括成纤维细胞、免疫细胞、骨髓来源未成熟细胞(Bone marrow derived immature cell, BMDC)等。近年的研究发现：TME中的肿瘤相关成纤维细胞(Tumor-associated fibroblast, TAF)可以通过诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)从而促进肿瘤的进展；TME中的细胞因子和趋化因子也可以通过多种途径来调节肿瘤的进展。然而,肿瘤所在组织的正常上皮细胞及血管内皮细胞对肿瘤发生发展的作用研究罕见报道。在本课题中的第一部分,我们运用不同的细胞培养模型：双层六孔板共培养肝癌细胞和肝脏永生化正常上皮细胞,双层六孔板共培养肝癌细胞和血管内皮细胞,人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的条件培养基培养肝癌细胞,尝试着揭示TME的不同成分在肝癌侵袭转移中的作用并探索相关机制。在第一部分的基础上,我们进一步阐明了人胚肺成纤维细胞(MRC-5)影响肝癌细胞侵袭及迁移,增殖和凋亡等生物学行为的分子机制。进一步认识了肝癌术后复发及转移的机理,为下一步的以TME为靶点的分子治疗提供了新的思路。第一部分类似上皮间质转化(EMT-like precession)及间质上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition, MET)体外诱导过程目的：上皮间质转化(EMT)及间质上皮转化(MET)与肿瘤的远处转移密切相关。目前认为,不同成分的TME能分别诱导EMT及MET。本实验通过共培养肝癌细胞与肝脏永生化正常上皮细胞,共培养肝癌细胞与血管内皮细胞,MRC-5条件培养基(Conditioned medium, CM)培养肝癌细胞,模拟TME与肿瘤细胞的相互作用,探索能否在体外诱导肿瘤细胞发生EMT及MET,并尝试阐述相关的分子机制。方法：共培养模型：双层六孔板共培养肝癌细胞与肝脏永生化正常上皮细胞,双层六孔板共培养肝癌细胞与血管内皮细胞。CM培养模型：分别用MRC-5,肝脏永生化正常上皮细胞及血管内皮细胞的CM培养肝癌细胞。培养一定时间后,通过transwell方法检测肝癌细胞侵袭及迁移能力是否发生改变,并用蛋白质印迹法(Western blot)检测上皮标志物(Epithelial marker),间质标志物(Mesenchymal marker), EMT相关的转录因子(EMT-related transcription factors, EMT-related TFs)及基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteases, MMPs)在蛋白水平的表达情况。之后通过激光共聚焦(Confocal laser scanning microscope, CLSM)检测E-钙粘素/β-连环蛋白复合体(E-cadherin/p-catenin complex),α-连环蛋白(a-catenin), γ-连环蛋白(γ-catenin)在肝癌细胞膜上的表达情况,检测波形蛋白(Vimentin), N-钙粘素(N-cadherin), Snail蛋白,Slug蛋白及Twist1蛋白在肝癌细胞中的表达量,并确定肌动蛋白(Actin)的存在形式。应用RT-PCR检测层粘连蛋白(Laminin)及整合素(Integrin)在与血管内皮细胞共培养90天后的肝癌细胞,MRC-5-CM,肝脏永生化正常上皮细胞及血管内皮细胞的CM培养28天后的肝癌细胞及miR-200a mimics转染后的肝癌细胞中mRNA水平的表达情况。结果：肝癌细胞与肝脏永生化正常上皮细胞及与血管内皮细胞共培养44天后其侵袭及迁移能力较对照组显著降低(P<0.05)；a-catenin, β-catenin和E-cadherin蛋白在细胞膜上的表达较对照组增高,说明E-cadherin/catenin complex保持得更完整；另外,纤维状肌动蛋白(Fibros actin, F-actin)表达较对照组减少。MRC-5-CM培养肝癌细胞14天后,细胞形态伸展,变得细长,F-actin增多,侵袭及迁移能力较对照组显著增强(P<0.05)。肝脏永生化正常上皮细胞及血管内皮细胞的CM培养14天后的肝癌细胞的生物学行为没有发生明显的改变。RT-PCR结果显示：lamininA1, A2及integrinA4, A11, AL, AM, AV, B6, B7, B8在MRC-5-CM培养28天后的肝癌细胞中的表达较对照组显著增高,integrinB4显著降低。相反,lamininA1, A2及integrinA4, A11, AL, AM, AV, B6, B7, B8在与血管内皮细胞共培养90天后的及miR-200a mimics转染后的肝癌细胞中的表达较对照组显著降低,integrinB4却显著增高。结论：肝脏永生化正常上皮细胞及血管内皮细胞能诱导肝癌细胞发生MET, MRC-5能诱导肝癌细胞发生EMT-like precession. TME诱导肝癌细胞发生EMT/MET通过调节E-cadherin/catenin complex, laminins, integrins蛋白的表达。第二部分人胚肺成纤维细胞MRC-5的条件培养基通过多条途径调节肝癌细胞的侵袭,迁移,增殖和凋亡目的：MRC-5的条件培养基(CM)能促进乳腺癌细胞的侵袭及转移,但其对肝癌细胞的作用尚未被很好的研究。在本课题中我们应用了一系列的细胞生物学实验来验证MRC-5-CM在肝癌细胞侵袭,迁移及生长中的作用,并尝试阐述其分子机制。方法：MRC-5-CM培养肝癌细胞21天,采用流式细胞仪(Flow cytometry, FC)检测肝癌细胞活力的改变,采用transwell检测其侵袭及迁移能力的改变。最后应用Western blot和免疫荧光技术(Immunofluorescence, IF)等实验方法对MRC-5-CM在肝癌细胞中的作用机制作出探讨。结果：FC检测结果提示MRC-5-CM诱导肝癌细胞株Bel-7402发生了G1期阻滞(P=0.002),S期细胞百分率较对照组显著降低(P=0.001)；然而,MRC-5-CM诱导肝癌细胞株MHCC-LM3发生了S期阻滞,S期细胞百分率较对照组明显增高(P=0.017),G2/M期细胞百分率显著降低(P=0.011)。同时,我们还发现MRC-5-CM明显抑制了Bel-7402的凋亡(P=0.000),然而,MRC-5-CM明显诱导了MHCC-LM3的凋亡(P=0.002)。通过Western blot检测细胞周期蛋白(Cyclin),细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI), P53,视网膜母细胞瘤抑制蛋白(Retinoblastoma tumor suppressor protein, RB),磷酸化的视网膜母细胞瘤抑制蛋白(phosphorylated RB, pRB),抗凋亡Bcl-2蛋白家族成员(Pro-survival Bcl-2family proteins)和促凋亡Bcl-2蛋白家族成员(Pro-apoptosis Bcl-2family proteins),结果提示MRC-5-CM通过多条途径影响肝癌细胞的活力,包括通过调节上述经典的周期和凋亡相关蛋白的表达。Transwell结果提示MRC-5-CM能明显促进肝癌细胞的侵袭及迁移(P<0.05)。Western blot检测结果提示MRC-5-CM促进肝癌细胞的侵袭及迁移不是通过上调EMT-related TFs (Snail/Twist1/ZEB-1/ZEB2)进而诱导肝癌细胞发生经典的EMT; MRC-5-CM能上调a6,β3, β4,β7-integrin蛋白,并激活下游的FAK/Src信号通路(integrin/FAK/Src signaling pathway); MRC-5-CM能上调激活的MMP-2. IF结果提示MRC-5-CM能显著破坏肝癌细胞膜上的E-cadherin/catenin complex进而诱导非经典的上皮间质转化(Non-classical EMT)。结论：MRC-5-CM通过诱导肝癌细胞发生非经典的上皮间质转化(Non-classieal EMT),激活integrin/FAK/Src signaling pathway和上调激活的MMP-2等三个方面促进肝癌细胞的侵袭及迁移能力,而且这三个方面是相互关联的；MRC-5-CM通过多条途径调节肿瘤细胞的增殖和凋亡,肿瘤细胞不同,影响也不尽相同。