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肾癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,肾癌起病隐匿，不易早期诊断，死亡率高，目前对于T3期以前的肾癌仍采用手术切除为主，生物治疗为辅。对晚期转移性肾癌的治疗主要依赖生物治疗，由于缺乏特异性靶点，对癌细胞的抑制和杀伤作用非常有限。因而，欲对肾癌发生发展及转移机制有深层次的认识，需从基因或分子水平寻找突破口。PI3K-Akt信号通路是研究较为成熟的信号通路，它的异常活化状态在肿瘤发生中起重要作用，包括肾肿瘤的发生，因此PI3K-Akt信号通路有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点。LY294002是一种可渗透细胞的特定PI3K抑制剂，其主要作用是使Akt/PKB失活,从而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。LY294002作用于肿瘤细胞，诱导明显的核固缩和减少细胞质体积。在结肠癌细胞中，使磷酸化Akt (Ser473)的表达下降，明显抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡， LY294002作用于细胞凋亡的效果可用于研究PI3K激活通路和癌细胞凋亡之间关系，然而LY294002在肾癌中的研究却少有报道。本文应用LY294002作用于人肾透明细胞癌786-0细胞系，探讨LY294002对人肾透明细胞腺癌细胞增殖和凋亡的影响，从而揭示LY294002在肾癌细胞中的作用，为其肾癌的临床治疗奠定基础。目的本研究目的在于应用PI3K高特异抑制剂2－（4－吗啉基）－8－苯基－4氢－1－苯并吡喃－4－酮（LY294002）作用于人肾透明细胞癌786-0细胞系，探讨LY294002对人肾透明细胞癌细胞凋亡的影响及机制，从而为其临床治疗的研究奠定基础。方法（1）人肾透明细胞癌786-0细胞系培养，建立细胞模型。（2）将对数生长期的肾透明细胞癌细胞分组培养。用不同药物浓度的LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)处理肾透明细胞癌细胞, MTT法检测癌细胞在不同的作用时间(24h、48h、72h)下的OD值，计算增殖抑制率,绘制肾癌细胞浓度-抑制率曲线及时间-抑制率曲线。用Hoechst染色法观察肾透明细胞癌细胞，经LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL）不同的作用时间(24h、48h、72h)下,细胞凋亡情况。（3）采用RT-PCR法分别检测LY294002在不同浓度及时间点对786-O细胞处理后细胞的PI3K、mTOR、Akt mRNA的表达情况，探讨其对PI3K、mTOR、Akt mRNA表达的影响，及其对786-O细胞增殖的影响。结果（1）通过MTT法检测LY294002在24、48、72h均表现出增殖抑制作用，当LY294002浓度从1μg/mL增加到40μg/mL时，作用24h细胞抑制率从6%增加到55%，作用48h时，细胞抑制率从12%增加到78%，作用72h时细胞抑制率从14%增加到84%，同一时间不同浓度的各组细胞与阴性对照组相比，抑制率有统计学意义（P<0.05或0.01），提示随着LY294002浓度的增加，其抑制786-O细胞增殖的作用逐渐增加。用倒置显微镜下观察LY294002用药对786-O细胞生长及形态的影响，各浓度LY294002作用48h时细胞形态变化最为典型。结果显示，相对于正常细胞，LY294002可以令细胞生长受到不同程度的抑制，表现出浓度依赖性变化。正常细胞的形态整齐，边缘清晰，细胞排列紧密，而随药物浓度的增加，药物作用下细胞变圆漂浮无法正常贴壁，细胞固缩，细胞密度减少。（2）通过Hoechst染色法在荧光显微镜下观察对照组细胞核呈弥散均匀淡蓝色的荧光；出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状亮蓝色荧光；相对于未经药物处理的786-0细胞，1μg/mL的药物处理48h后，细胞形态还未出现明显的变化；2.5μg/mL药物处理可见个别细胞内出现染色质凝聚，出现凋亡小体；5μg/mL药物处理染色质荧光增强，出现凋亡小体的细胞增多；10μg/mL药物处理可见凋亡前期的细胞进一步增多；20μg/mL药物处理可见凋亡小体突破细胞膜开始释放；40μg/mL药物处理可见大部分细胞凋亡小体释放，完成凋亡。（3）在LY294002处理细胞48h，采用1、2.5、5、10、20、30、40μg/mL浓度处理下，PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达显著受到抑制，并且呈现出随药物浓度的变化出现抑制程度增大的正比关系；细胞增殖实验显示随着药物浓度及其作用时间的延长，其抑制肿瘤作用逐渐增加。结论我们的研究结果发现，LY294002能够明显抑制人肾透明细胞腺癌细胞786-O细胞体外增殖能力，增殖抑制作用呈时间和剂量依赖，在小剂量下对786-O细胞的形态及生长有明显影响；同时LY294002可促进786-O细胞的凋亡。LY294002可通过抑制PI3K/Akt信号转导通路抑制786-O细胞增殖、诱导其凋亡。PI3K/Akt信号转导通路可能参与肾癌的发生发展，诱导肿瘤细胞凋亡可能是LY294002发挥抗癌作用的重要机制。PI3K/Akt可能成为肾癌治疗的一个新的靶点，利用LY294002可能对肾癌患者的临床治疗带来福音。