论文部分内容阅读
羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)是一种来源于植物的重要抗癌药物,具有高效、低毒、抗癌谱广、无交叉耐药等优点。研究发现,HCPT完整的内酯环结构是其发挥抗肿瘤作用的关键。然而,内酯型HCPT难溶于水,且在生理环境中不稳定;开环的羧酸盐型HCPT水溶性好,但是抗癌活性低且毒副作用严重。HCPT在干扰细胞核DNA复制的同时可引发细胞线粒体功能障碍,导致线粒体膜电位降低,线粒体膜通透性改变,释放细胞色素C,引起细胞凋亡。近年来研究发现,纳米药物递送系统在改善药物水溶性和增强药物疗效方面效果显著。因此,构建细胞核与线粒体双靶向HCPT纳米递药系统,通过肿瘤组织的渗透与滞留增强效应(EPR效应)将HCPT富集于肿瘤部位,增强肿瘤细胞对HCPT的摄取,增加HCPT在细胞核和线粒体的分布量,对增强HCPT的抗肿瘤作用,减少毒副作用具有重要意义。目的:以叶酸(FA)为肿瘤细胞靶向配体,以三苯基磷(TPP)为线粒体和细胞核靶向分子,以聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)为疏水材料,以聚乙二醇(PEG)为亲水材料,分别构建包封HCPT的具有p H响应和氧化还原响应的细胞核与线粒体双靶向纳米粒,旨在增加内酯型HCPT的稳定性,改善HCPT在体内的分布,促进肿瘤细胞对药物的摄取,提高HCPT的抗肿瘤活性。方法:1.以FA、TPP、PLGA、PEG为原料,合成PLGA-hyd-PEG4k-FA、PLGA-SS-PEG4kFA和PLGA-PEG2k-TPP三种聚合物,并通过核磁氢谱(1H NMR)和红外图谱(IR)对目标产物进行结构鉴定。2.采用乳化溶剂挥发法,以PLGA-PEG2k-TPP和PLGA-hyd-PEG4k-FA为两亲性材料,制备包封HCPT纳米粒HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA;以PLGAPEG2k-TPP和PLGA-SS-PEG4k-FA为两亲性材料,制备包封HCPT纳米粒HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA。以粒径、zeta电位、多分散系数(PDI)和载药量为指标,优化制备载HCPT纳米粒的处方。3.利用zeta电位和激光粒度测定仪、荧光分光光度计和透射电子显微镜(TEM)对载药纳米粒的粒径、zeta电位、载药量、外观形态以及稳定性进行表征。4.采用透析法结合荧光分光光度计观察载药纳米粒在不同的释放介质中的释药特性;通过检测HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA在p H值为5.0、6.5、7.4的PBS中zeta电位变化,考察其p H响应性;通过检测HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGASS-PEG4k-FA在GSH浓度为0.1μM和10 m M的PBS(p H7.4)中zeta电位变化,考察其氧化还原响应性。5.通过MTT法检测载药纳米粒对Hep G2细胞和SW620细胞的细胞毒性;利用caspase-3试剂盒检测载药纳米粒诱导SW620细胞发生凋亡的作用;采用流式细胞术检测载药纳米粒对SW620细胞周期的影响;利用激光共聚焦显微镜观察Hep G2细胞和SW620细胞对载药纳米粒的摄取和纳米粒转运的HCPT在Hep G2细胞和SW620细胞中的分布;通过JC-1试剂观察载药纳米粒对SW620细胞线粒体膜电位的影响。6.采用皮下注射SW620细胞构建人结肠癌荷瘤裸鼠模型;利用活体成像仪和组织冰冻切片DAPI染色法观察载药纳米粒给药后HCPT在荷瘤裸鼠体内的分布;通过测定荷瘤裸鼠肿瘤体积、体重变化及肿瘤抑制率评价载药纳米粒的体内抗肿瘤活性;通过H&E染色观察荷瘤裸鼠各器官和肿瘤的组织形态变化。结果:1.1H NMR和IR鉴定结果显示所合成的PLGA-hyd-PEG4k-FA、PLGA-SS-PEG4k-FA和PLGA-PEG2k-TPP均为目标产物。2.制备HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA和HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA的最佳处方分别为PLGA-PEG2k-TPP:PLGA-hyd-PEG4kFA=4:16(mg/mg),PLGA-PEG2k-TPP:PLGA-SS-PEG4k-FA=12:8(mg/mg)。3.HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA的平均粒径为104 nm,zeta电位为-8.1 m V,载药量为6.56%;HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA的平均粒径为98 nm,zeta电位为-18.6 m V,载药量为6.54%。TEM图像显示两种纳米粒为球形。两种纳米粒在p H7.4的PBS中,8天内粒径分布无明显变化。4.体外释药实验结果显示,随着释放介质p H值的降低,HCPT@PLGA-PEG2kTPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA的累积释药量显著增加;随着释放介质中GSH浓度的升高,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA的累积释药量明显增多。当介质p H值从7.4变为5.0时,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA的zeta电位可发生电荷翻转;当介质GSH浓度从0.1μM增加到10 m M时,HCPT@PLGA-PEG2kTPP/PLGA-SS-PEG4k-FA的zeta电位也能发生电荷翻转。5.MTT结果显示,与Hep G2细胞和SW620细胞分别孵育48 h后,HCPT@PLGAPEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA的细胞毒性明显高于游离HCPT和HCPT@PLGAhyd-PEG4k-FA;HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA的细胞毒性明显高于游离HCPT和HCPT@PLGA-SS-PEG4k-FA。Caspase-3活性检测结果表明,相比于游离HCPT,载药纳米粒能显著提高SW620细胞的caspase-3活性水平;相比于HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGASS-PEG4k-FA提高SW620细胞caspase-3活性的作用更强。细胞周期影响实验结果表明,与游离HCPT相比,载药纳米粒诱导SW620细胞发生S期阻滞的作用更强。6.Hep G2细胞和SW620细胞对载药纳米粒的摄取具有时间依赖性。孵育4.0 h时,肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取明显高于游离HCPT,而且肿瘤细胞对HCPT@PLGAPEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA的摄取显著高于HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGAhyd-PEG4k-FA。相比于HCPT@PLGA-hyd-PEG4k-FA,HCPT@PLGA-PEG2kTPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA转运的HCPT在细胞核与线粒体中分布的量显著增多;与HCPT@PLGA-SS-PEG4k-FA相比,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA转运的HCPT在细胞核与线粒体中分布的量显著增多。7.JC-1检测结果显示,相比于游离HCPT,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hydPEG4k-FA和HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA能显著降低SW620细胞线粒体膜电位;与HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA相比,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA降低SW620细胞线粒体膜电位的作用更强。8.活体成像和组织冰冻切片DAPI染色结果显示,与游离HCPT治疗组相比,载药纳米粒给药12 h后,在裸鼠肿瘤部位HCPT荧光信号显著增强并持续到给药后24 h,纳米粒表现出良好的肿瘤靶向性。体内抗肿瘤活性结果表明,相比于游离HCPT治疗组,载药纳米粒能够显著地抑制肿瘤生长,而且对裸鼠体重无明显影响;与HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA相比,HCPT@PLGA-PEG2kTPP/PLGA-SS-PEG4k-FA对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率显著提高。H&E染色结果表明载药纳米粒对荷瘤裸鼠的主要器官组织无明显损伤,但能显著地破坏肿瘤组织,降低肿瘤细胞密度。结论:HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA和HCPT@PLGA-PEG2kTPP/PLGA-SS-PEG4k-FA分别具有良好的p H响应性和氧化还原响应性。HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4k-FA和HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGASS-PEG4k-FA可有效增强肿瘤细胞对HCPT的摄取,提高HCPT在细胞核与线粒体中的分布,使HCPT发挥更强的细胞毒性。HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hydPEG4k-FA和HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA具有良好的体内肿瘤靶向性,增强了HCPT的体内抗肿瘤活性。与HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-hyd-PEG4kFA相比,HCPT@PLGA-PEG2k-TPP/PLGA-SS-PEG4k-FA具有更好的体内抗肿瘤效果。